[发明专利]一种高效表达anti-hEGFR基因的真核表达载体构建方法

摘要

本发明公开了一种高效表达anti‑hEGFR基因的真核表达载体构建方法，属于分子生物学领域。针对重组人表皮生长因子受体抗体(anti‑hEGFR)基因的克隆及高效真核表达载体构建，以含anti‑hEGFR全长基因的质粒为模板，设计引物克隆抗体轻链及重链，在真核表达载体上插入了IgKappa Leader和IRES EGFP来增强蛋白表达及方便后续分选实验，经过上述方式成功获得真核表达的蛋白anti‑hEGFR，其将在治疗EGFR过表达引起的癌症方面发挥显著效果。

主权项

一种高效表达anti‑hEGFR基因的真核表达载体构建方法，其特征在于以下步骤：(1)hEGFR抗体重链及轻链基因的克隆：以含anti‑hEGFR全长基因的质粒为模板，设计引物pl1、pl2，ph1、ph2两对引物分别进行全长抗体轻链和重链基因的PCR扩增；(2)Peedual‑IRES‑EGFP‑hEGFR真核表达载体的构建：将轻链和重链插入到pKlight载体，得到质粒pK‑LC和pK‑HC。将pK‑LC质粒经酶切后连接到pee12.4真核表达载体中；将pK‑HC质粒及IRES EGFP经酶切后连接到pee6.4载体。重组后的pee6.4和pee12.4载体均用Sal I/Not I双酶切，回收大片段并使之相连，构建出同时具有抗体轻链和重链的双顺反子真核表达载体，命名为peedual‑IRES‑EGFP‑hEGFR；(3)提取去内毒素的peedual‑IRES‑EGFP‑hEGFR质粒。