[发明专利]一种非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒，属于生物检测技术领域。该方法包括如下步骤（1）提取植物病原菌的基因组DNA；（2）设计扩增引物；（3）进行非对称PCR反应；（4）设计捕捉探针；（5）制备纳米金探针；（6）制备胶体金核酸试纸条；（7）样品的检测。使用该方法检测致病疫霉的试剂盒包括引物、酶、缓冲液、dNTPs、探针和胶体金核酸试剂条等。本方法将基于共有引物介导的非对称PCR与试纸条检测结合，可以实现定性或者定量检测，成本低、检测速度快、特异性好、灵敏度高、使用安全。

主权项

一种基于共有引物介导的非对称PCR的试纸条检测植物病原菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）模板的准备：提取植物病原菌的DNA；（2）设计成三条用于扩增植物病原菌保守序列的引物：共有引物、上游引物和下游引物，上游引物的5’端添加上共有引物的序列；（3）非对称PCR反应：将步骤（1）制备的模板、步骤（2）设计合成的引物进行非对称PCR扩增反应，得到单链DNA产物；（4）探针的设计：根据单链DNA产物的序列设计三条捕捉探针，探针1和探针2分别和单链DNA产物的两端互补，探针3与探针1完全互补；三条探针的一端都修饰有功能基团；（5）纳米金探针的制备：将步骤（4）中所设计合成的探针1与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针；（6）胶体金核酸试纸条的制备胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板依次搭接固定于底板上组装得到胶体金核酸试纸条；所述的金垫包埋有步骤（5）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线和含链霉亲和素和探针2的检测线；（7）检测：将由步骤（3）得到的DNA产物与检测缓冲液混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加检测缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测植物病原菌，仅有控制线变成红色表明没有待测植物病原菌。