[发明专利]海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺

摘要

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺；本发明直接从海藻渣中筛选产纤维素酶菌株，且诱导纤维素酶产生的底物也采用海藻渣，可以防止其他来源的产纤维素酶的菌株产生的纤维素酶对海藻渣的降解专一性不强，影响酶的催化效率；传统的分离海藻渣中纤维素和珍珠岩的方法是离心和过滤，这两种方法对于海藻渣的利用率较低，且分离成本很高，微生物发酵法可以使分离出的珍珠岩作为助滤剂重复使用或作为保温材料，同时海藻渣粗纤维降解产生的糖液可直接作为含DHA微藻生长的营养液或其他藻类等微生物生长的碳源，工艺简单，在大规模生产中可以推广应用，具有循环经济价值。

主权项

1.海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：产纤维素酶的菌株的筛选：选取海藻渣腐烂部位，接种于海藻渣和蒸馏水配制成的匀浆培养液中，将富集后的发酵液采用10倍梯度法稀释后，再涂布在初筛培养基平板上，待长出菌落后，用接种针挑出同一平板上不同形态的菌落，将菌落转接到复筛培养基上进行单菌落分离，最终得到多株纯的单一菌落；将得到的单一菌落用刚果红染液染色30min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色15min，测量透明圈和菌株直径的大小，计算透明圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株；将种子液按5%的量接种于产酶培养基上，收集上清液测定滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMC)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡聚糖苷酶的酶活力，将酶活力高的菌株在斜面上连续传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况，保存遗传稳定性较强的菌株；产酶条件的优化：将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养基中培养至对数期进行产酶条件的优化，探讨不同的pH、温度、氮源、底物浓度、摇床速度、培养时间对藻渣纤维素的分解及寡糖积累的影响，选择以下的条件培养：①培养基中初始pH值分别用1N H2SO4或1N NaOH调整为pH5.0-8.0之间，每隔1个pH值设置为一个测试点；②测试温度调节为25℃-40℃，每隔5℃为一设置温度；③酵母粉的浓度设置为0.5 g/L-3.5 g/L；④海藻渣的浓度均分为8个梯度：依次为5.0 g/L、6.0 g/L、7.0 g/L、8.0 g/L、9.0 g/L、10.0 g/L、11 g/L和12.0 g/L来确定最佳底物浓度，能够使海藻渣纤维素最大程度的降解；⑤摇床速度（溶解氧含量）：100rpm，130rpm，150rpm，180rpm；⑥培养时间为12-120h，在本发明的寡糖产量达到最高时结束发酵；每6h取样，分别测定发酵液上清的酶活性及糖产量，经如上述的发酵培养方法，确定产生寡糖的最优发酵条件；c、利用产纤维素酶的菌株处理海藻渣制备含DHA微藻的培养基：将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养液中，28-29℃、180-185rpm摇床培养至对数期，取海藻加工后产生的海藻渣，按比例配置发酵培养基；d、纤维素降解率的测定：将上述培养基恒温发酵，每发酵12h取样一次，配置葡萄糖标准溶液及DNS试剂，在550nm处用分光光度计测定反应溶液的OD值，以葡萄糖浓度作为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标准方程，计算寡糖含量，发酵结束后，过滤剩余藻渣纤维素及珍珠岩，检测纤维素降解率，糖化液可直接作为含DHA微藻的培养基的碳源添加使用。