[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟对细胞微核率影响的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞微核率影响的方法，属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬液的制备、单细胞悬浮液的细胞浓度计算、细胞接种、加入受试物、收获细胞、低渗、滴片、染色、微核计数、结果判定等步骤。本发明综合考察胶基型嚼烟细的溶出方式、暴露途径和作用方式，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法，且根据胶基型嚼烟样品作用靶细胞选取了人口腔角质细胞HOK作为胶基型嚼烟体外微核试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合胶基型嚼烟的体外微核试验检测方法，具有良好的应用前景。

主权项

一种用于检测胶基型嚼烟对细胞微核率影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基OKM中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至1.0～1.5×105个/mL，再按接种量为200μL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；步骤（5），加入受试物：受试物分为三组，细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；首先在细胞对照组和阳性对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基，在检测样品组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和不同剂量的步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度在大于0%、小于等于60%的范围内；细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为2000μl/孔；再在细胞对照组、阳性对照组和检测样品组对应的孔内加入1mg/mL的细胞松弛素水溶液6μl，接着，在阳性对照组相应的孔内加浓度为1mg/mL的环磷酰胺溶液0.5μl；接之后置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；步骤（6），收获细胞：用浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液将细胞从步骤（5）培养后的细胞培养板的孔内分别消化下来，得到第一细胞悬浮液；步骤（7），低渗：对步骤（6）每孔得到的第一细胞悬浮液进行分别离心分离，移除上清液后，加入浓度为0.075mol/L的氯化钾溶液3mL并吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇和冰醋酸的混合溶液2mL，再进行离心分离，将上清液和细胞分离；所述的甲醇和冰醋酸的混合溶液为甲醇和冰醋酸按体积比4:1的比例混匀配制而成；步骤（8），滴片：用甲醇和冰醋酸的混合溶液0.5ml吹打经步骤（7）每孔得到的细胞，形成第二细胞悬浮液，再将第二细胞悬浮液滴在载玻片上自然晾干；步骤（9），染色：将步骤（8）晾干后的载玻片放置于Gimsa染液中染色15min后，再用水清洗载玻片至无浮色并自然晾干后保存备用；步骤（10），微核计数：挑选步骤（9）的载玻片，至少观察1000个双核细胞，并计数微核率；所述挑选是细胞边界清晰且细胞分散不成团的视野；步骤（11），结果判定：将阳性对照组的微核率与细胞对照组的微核率相比，如无显著差异，则表明试验无效，需重新按照步骤（1）‑步骤（10）进行试验；如有显著差异，则表明试验有效；在试验有效的情况下，将检测样品组的微核率与细胞对照组的微核率相比，如有显著差异，且检测样品组的剂量与检测样品组的微核率之间有剂量反应关系的，即为阳性结果，该胶基型嚼烟对细胞有遗传毒性，对细胞微核率有影响；将检测样品组的微核率与细胞对照组的微核率相比，如无显著差异，且检测样品组的剂量与检测样品组的微核率之间无剂量反应关系的，则为阴性结果，该胶基型嚼烟对细胞无遗传毒性，对细胞微核率没有影响。