[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟对细胞微核率影响的方法

说明书

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域，具体涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞微核率影响的方法。

背景技术

根据检测的遗传学终点不同，目前已建立的遗传毒性短期检测方法超过200种。细胞微核率是遗传毒性评价的关键组合指标之一，微核试验由于其检测终点明确，方法简便，易于开展等特点，在食品、医药产品、工农业产品、等健康相关产品的安全评价、遗传损害的监测、特定人群的突变损伤检测和早期预报等方面得到了广泛的应用。2009年经济合作与发展组织（OECD）公布了哺乳动物体外微核试验指导文件，初步建立了哺乳动物体外微核试验的统一标准。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用体外微核试验对卷烟烟气冷凝物潜在的遗传毒性进行检测。该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。

烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟和不含烟叶原料的新型口含烟（如胶基型嚼烟）。胶基型嚼烟是一种以烟草或烟草提取物为有效组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品。咀嚼过程中烟草或烟草提取物及其他食品添加剂缓慢释放到唾液中，其释放方式有别于传统卷烟和含烟叶原料的Snus型口含烟，因此，有必要针对胶基型嚼烟自身特点建立适合胶基型嚼烟的体外微核试验检测方法，确保产品的安全性。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，衡量胶基型嚼烟的安全性，提供一种用于检测胶基型嚼烟对细胞微核率影响的方法该方法是在传统卷烟制品体外微核试验方法的基础上改进得到的一种适合于胶基型嚼烟遗传毒性检测的体外微核试验方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测胶基型嚼烟对细胞微核率影响的方法，包括如下步骤：

步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基OKM中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；

步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO₂培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm²生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；

步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至1.0～1.5×10⁵个/mL，再按接种量为200μL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO₂培养箱内培养24h；

步骤（5），加入受试物：受试物分为三组，细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；首先在细胞对照组和阳性对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基，在检测样品组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和不同剂量的步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度在大于0%、小于等于60%的范围内；细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为2000μl/孔；

再在细胞对照组、阳性对照组和检测样品组对应的孔内加入1mg/mL的细胞松弛素水溶液6μl，接着，在阳性对照组相应的孔内加浓度为1mg/mL的环磷酰胺溶液0.5μl；接之后置于37℃、5%CO₂培养箱内培养24h；所有孔的加样具体如表1所示。

表1微核试验加样表

步骤（6），收获细胞：用浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液将细胞从步骤（5）培养后的细胞培养板的孔内分别消化下来，得到第一细胞悬浮液；