[发明专利]分离土壤中大丽轮枝菌的方法

摘要

本发明涉及微生物的分离，具体涉及分离土壤中大丽轮枝菌的方法。所述方法包括步骤：土壤样品预处理；制备选择性培养基；土壤样品水筛处理；土壤样品蔗糖密度梯度离心；涂布、培养；单孢纯化；培养上述菌落。本发明的分离土壤中大丽轮枝菌的方法步骤简单易操作，分离效率较高。

主权项

1.分离土壤中大丽轮枝菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)土壤样品预处理，土壤样品风干以杀死菌丝和孢子，使含水量在10％左右，研磨后过筛去除大颗粒，收集通过筛孔的土样；(2)制备选择性培养基，选择性培养基配方为，2g硝酸钠，1g磷酸二氢钾，0.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钾，0.01g七水合硫酸亚铁，2g多聚半乳糖醛酸，1mL tergitol NP10，15g琼脂，用水定容至1L，调节pH值至6.4，灭菌后冷却，添加10％体积的抗生素混合液，每10mL抗生素混合液含有6mg链霉素，6mg氯霉素，6mg金霉素和0.6mg维生素H；(3)土壤样品水筛处理，将待测土样充分混匀，土样以无菌水定容，震荡，在水流下将土壤悬液过两层筛网，上层用70目，下层500目，将500目筛网上面的残留物用无菌水冲洗，收集、定容至，离心弃上清；(4)土壤样品蔗糖密度梯度离心，将收集的土壤颗粒进行蔗糖密度梯度离心，将上清液中加入无菌水，用微孔滤膜进行过滤；(5)涂布、培养，过滤后，以无菌水清洗微孔滤膜，收集洗涤液，并涂布在选择性培养基的平板上，将涂布后的平板放置在25℃的恒温培养箱中培养，培养3～4d，挑取菌落形态类似大丽轮枝菌，且菌落中央含有黑色微菌核的单个无污染的菌落，转移到PDA培养基上培养；(6)单孢纯化，从上述菌落边缘部分挑取带有菌丝的培养基，制成孢子悬浮液，浓度为300～400个孢子/mL，将孢子悬浮液均匀涂布于水琼脂平板上，置25℃条件下暗培养30小时，观察孢子萌发的情况，标记单个萌发的孢子，挑取带有单菌落的饼块到PDA平板上，于25℃黑暗培养；(7)培养上述菌落，观察菌落形态，显微镜下观察菌丝及孢子形态，并结合分子检测，鉴定大丽轮枝菌。