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公布日期
2020-09-11 公布专利
2020-09-08 公布专利
2020-09-04 公布专利
2020-09-01 公布专利
2020-08-28 公布专利
2020-08-25 公布专利
2020-08-21 公布专利
2020-08-18 公布专利
2020-08-14 公布专利
2020-08-11 公布专利
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[发明专利]分离土壤中大丽轮枝菌的方法在审

发明涉及微生物的分离,具体涉及分离土壤中大丽轮枝菌的方法。所述方法包括步骤:土壤样品预处理;制备选择性培养基;土壤样品水筛处理;土壤样品蔗糖密度梯度离心;涂布、培养;单孢纯化;培养上述菌落。本发明的分离土壤中大丽轮枝菌的方法步骤简单易操作,分离效率较高。

技术领域

本发明涉及微生物的分离,具体涉及分离土壤中大丽轮枝菌的方法。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的植物黄萎病为单循环病害,初侵染来源于土壤及植株残体中的微菌核。大丽轮枝菌是典型的土传病原真菌,可以侵染400多种植物。

对土壤中大丽轮枝菌的检测和分离纯化是进行病原菌遗传多样性和病害防治研究的基础。大丽轮枝菌种群内具有非常丰富的遗传多样性,在大田中,经常发现相同棉花品种在同一块棉田中发病棉株表现不同的症状类型(即症状多样性),并且棉株的受害程度也表现各异。造成这种现象的原因可能有微菌核在土壤中的分布不均匀、棉花植株个体间抗病性差异或者土壤中棉花黄萎病菌的致病力变异。但是迄今为止,关于土壤中大丽轮枝菌的群体遗传变异尚缺乏研究。其主要原因是现有土壤中大丽轮枝菌的分离纯化技术耗时长、污染率高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速、高效地分离纯化土壤中大丽轮枝菌。

根据本发明的分离土壤中大丽轮枝菌的方法,包括以下步骤:

(1)土壤样品预处理,土壤样品风干以杀死菌丝和孢子,使含水量在10%左右,研磨后过筛去除大颗粒,收集通过筛孔的土样;

(2)制备选择性培养基,选择性培养基配方为,2g硝酸钠,1g磷酸二氢钾,0.5g七水硫酸镁,0.5g氯化钾,0.01g七水合硫酸亚铁,2g多聚半乳糖醛酸,1mL tergitol NP10,15g琼脂,用水定容至1L,调节pH值至6.4,灭菌后冷却,添加10%体积的抗生素混合液,每10mL抗生素混合液含有6mg链霉素,6mg氯霉素,6mg金霉素和0.6mg维生素H;

(3)土壤样品水筛处理,将待测土样充分混匀,土样以无菌水定容,震荡,在水流下将土壤悬液过两层筛网,上层用70目,下层500目,将500目筛网上面的残留物用无菌水冲洗,收集、定容至,离心弃上清;

(4)土壤样品蔗糖密度梯度离心,将收集的土壤颗粒进行蔗糖密度梯度离心,将上清液中加入无菌水,用微孔滤膜进行过滤;

(5)涂布、培养,过滤后,以无菌水清洗微孔滤膜,收集洗涤液,并涂布在选择性培养基的平板上,将涂布后的平板放置在25℃的恒温培养箱中培养,培养3~4d,挑取菌落形态类似大丽轮枝菌,且菌落中央含有黑色微菌核的单个无污染的菌落,转移到PDA培养基上培养;

(6)单孢纯化,从上述菌落边缘部分挑取带有菌丝的培养基,制成孢子悬浮液,浓度为300~400个孢子/mL,将孢子悬浮液均匀涂布于水琼脂平板上,置25℃条件下暗培养30小时,观察孢子萌发的情况,标记单个萌发的孢子,挑取带有单菌落的饼块到PDA平板上,于25℃黑暗培养;

(7)培养上述菌落,观察菌落形态,显微镜下观察菌丝及孢子形态,并结合分子检测,鉴定大丽轮枝菌。

根据本发明的分离土壤中大丽轮枝菌的方法,在步骤(2)中,高压灭菌后,待培养基冷却到55℃,添加抗生素混合液。

根据本发明的分离土壤中大丽轮枝菌的方法,在步骤(3)中,土样以无菌水定容,用往复式摇床在室温175rpm转速下震荡1h,在水流下将土壤悬液过两层筛网,上层用70目,下层500目,将500目筛网上面的残留物用无菌水冲洗,收集、定容至20mL,1600×g离心5min,弃上清。

根据本发明的分离土壤中大丽轮枝菌的方法,在步骤(4)中,将收集的土壤颗粒悬浮在20mL 65%的蔗糖溶液中,1600×g离心20min,收集离心后的上清液,将剩余的沉淀部分重新悬浮于20mL 60%的蔗糖溶液中,1600×g离心20min,收集上清液,并与之前的混合在一起,将上清液中加入300mL无菌水,用孔径为20μm的微孔滤膜进行过滤。

根据本发明的分离土壤中大丽轮枝菌的方法,在步骤(5)中,过滤后,用无菌水清洗微孔滤膜放,收集洗涤液,并涂布在10个选择性培养基的平板上。将涂布后的平板放置在25℃的恒温培养箱中培养,培养3~4d,挑取菌落形态类似大丽轮枝菌,且菌落中央含有黑色微菌核的单个无污染的菌落,转移到PDA培养基上培养。

根据本发明的分离土壤中大丽轮枝菌的方法,在步骤(7)中,采用基于大丽轮枝菌的特异性引物行分子检测,所述引物的序列为

P1:5′-CATCAGTCTCTCTGTTTATACCAACG-3′,

P2:5′-CGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAA-3′。

本发明的分离土壤中大丽轮枝菌的方法步骤简单易操作,分离效率较高。

附图说明

图1为大丽轮枝菌形态特征,A和B分别为大丽轮枝菌在PDA培养基上培养6d菌落的正面和背面;C和D分别为大丽轮枝菌在PDA培养基上培养21d菌落的正面和背面;E为大丽轮枝菌分生孢子梗;

图2为琼脂糖凝胶电泳检测大丽轮枝菌,M:DNA ladder;从下至上依次为50、100、150、200、300、400和500bp;泳道1~泳道9分别为分离得到的大丽轮枝菌菌株;泳道10,阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,无特殊说明,均为常规方法。下述实例中所用的材料、试剂等,无特殊说明,均可从化商业途径得到。

实施例1

以中国农业科学院棉花研究所国家棉花黄萎病抗病鉴定病圃土壤为例。

1、土样采集及处理

采用对角线5点取样法采集病圃(10m×20m)土样,每点取地表15cm深度土芯,每点取样量一致,将同一病圃土样混合为一个土样,采集3个病圃,总共3个土样,室温(25±2℃)风干3周以杀死菌丝和孢子,使含水量在10%左右,用灭菌研钵轻轻研磨后过10目筛,去除植物残体、沙石等大颗粒,收集能通过筛孔的土样,装入聚乙烯密封袋中4℃保存备用。

2、选择性培养基的配制

2g硝酸钠,1g磷酸二氢钾,0.5g七水硫酸镁,0.5g氯化钾,0.01g七水合硫酸亚铁,2g多聚半乳糖醛酸,1mL tergitol NP-10(Sigma,UK),15g琼脂(Fluka,UK)用蒸馏水定容至1L,添加琼脂前用1M氢氧化钾调节pH值至6.4。高压灭菌后,待培养基冷却到55℃左右,添加10%体积过滤灭菌后的抗生素混合液(每10mL含有6mg链霉素,6mg氯霉素,6mg金霉素和0.6mg维生素H)。

3、土壤样品水筛处理

将待测土样充分混匀,称取20g置于200mL蓝盖瓶中,用无菌水定容至100mL。用往复式摇床在室温175rpm转速下震荡1h。在自来水水流下将土壤悬液过两层筛网,上层用70目,下层500目。将500目筛网上面的残留物用无菌水冲洗,收集至50mL离心管中,定容至20mL,1600×g离心5min,弃上清。

4、土壤样品蔗糖密度梯度离心

将剩余土壤颗粒全部悬浮在20mL 65%的蔗糖溶液中,1600×g离心20min,转移上清液至无菌的三角瓶中;将剩余的沉淀重新悬浮于20mL 60%的蔗糖溶液中,1600×g离心20min,收集上清液,并与之前的混合在一起,将上清液中加入300mL无菌水,用孔径为20μm的微孔滤膜进行过滤。

5、涂布、培养

申请号: 201711273106.9 申请日: 2017-12-06
公开/公告号: CN108018214A 公开/公告日: 2018-05-11
申请/专利权人: 中国农业科学院棉花研究所
发明/设计人: 魏锋;崔丽芳;朱荷琴;冯自力;冯鸿杰;师勇强;赵丽红;周京龙;袁媛
主分类号: C12N1/14
分类号: C12N1/14;C12N1/02;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12R1/645
搜索关键词: 分离 土壤 中大丽轮枝菌 方法
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