[发明专利]一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法

摘要

本发明公开了一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法。本发明利用分离自兰科植物菌根的内生真菌兰科丝核菌(Orchidaceous rhizoctonia)，将其与春剑根状茎的组织匀浆物混合做为接种剂，将春剑蒴果内成熟种子播于接种剂上萌发，于春剑原生野生环境建立菌植共生体系，获得春剑幼苗。具体包括兰科丝核菌培养、接种剂准备、蒴果表面消毒、共生体系建立、接种后管理、菌植体系镜检、菌根检验和幼苗回归等步骤。本发明技术可以实现春剑有性大量繁殖，对春剑育种和春剑资源的持续利用有重要理论与应用价值。

主权项

1.一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法，利用春剑根状茎的组织匀浆物培养兰科丝核菌为接种材料，接种经表面消毒的春剑蒴果，建立菌植共生体系，获得野外回归春剑幼苗，主要包括以下步骤：(1) 兰科丝核菌培养：将冷冻保藏于试管斜面上的兰科丝核菌活化后接于PAD培养基平板上，在恒温培养箱中25℃倒置培养10天；用打孔器打出直径为5mm的菌丝块备用；(2)接种剂准备：剪取健康完整的春剑肉质根经表面消毒后，与去离子水1：0.5（质量比)混合打成组织匀浆物后，接种直径为5mm的菌丝块，28℃暗培养7天作为接种剂备用；(3)蒴果表面消毒：用70%的酒精棉花擦拭蒴果外部后，将整个蒴果浸入加有少数展著剂的1.0%次氯酸钠溶液中消毒10min后备用；(4)混合接种：将表面灭菌后的蒴果，放在培养皿中以4号解剖刀将蒴果纵切开，并刮出种胚，用长镊子夹住蒴果中的棉絮状胎座束，在准备好的接种剂上来回轻扫，把种胚均匀播在接种剂上，然后将播有种胚的接种剂均匀撒在装有新鲜苔藓的育苗盘上；(5)共生体系培养：将接种后的育苗盘，放入春剑拟野生自然环境中培养，培养条件为：自然光照，自然温度，苔藓湿度控制在75‑85%，苔藓保持浅绿色缓慢生长；(6)共生体系镜检：获得完整的春剑幼苗后，用水洗净并剪取基部根段，滤纸吸干多余水分，用刀片拉片成薄且透明的切片，在显微镜下观察，同时种横向切开根段，切面朝上，粘于铜面上后放置在扫描电子显微镜下观察并照像，可观察到根内有典型兰科丝核菌特征，表明共生培养成功。