[发明专利]一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法

说明书

本发明公开了一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法。本发明利用分离自兰科植物菌根的内生真菌兰科丝核菌(Orchidaceous rhizoctonia)，将其与春剑根状茎的组织匀浆物混合做为接种剂，将春剑蒴果内成熟种子播于接种剂上萌发，于春剑原生野生环境建立菌植共生体系，获得春剑幼苗。具体包括兰科丝核菌培养、接种剂准备、蒴果表面消毒、共生体系建立、接种后管理、菌植体系镜检、菌根检验和幼苗回归等步骤。本发明技术可以实现春剑有性大量繁殖，对春剑育种和春剑资源的持续利用有重要理论与应用价值。

技术领域

本发明属于植物生物学领域。具体来说涉及一种利用兰科丝核菌(Orchidaceousrhizoctonia)和春剑组织匀浆物制作接种剂与春剑种子拟野生生境共生培养法，获得春剑幼苗的方法。

背景技术

春剑为兰科兰属植物，是十分重要的植物资源，具有较高的生态价值和经济价值，在野生资源中发掘的诸如“皇梅”、“玉海棠”等多次在兰博会上荣获金奖。长期以来，因盲目的、掠夺性的采挖，使得野生春剑资源濒临灭绝。但春剑的种子非常细小，没有胚乳，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质，且在5年内由其种子萌发成幼苗的几率一般低于5%。目前兰科植物种子的萌发，多采用人工培养基在无菌条件下进行非共生萌发，萌发率虽高，但在进行野外回归时，幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。通过种子和其有效萌发真菌在自然条件下的共生萌发，可有效地提高春剑杂交种子的萌发和发育，为春剑原生地增强型再引入和春剑突破性育种提供了简便的操作路径。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种有效兰科菌根真菌与春剑种子拟野生共生培养法，为实现春剑原生地增强型再引入和春剑突破性育种创造条件。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

本发明的技术方案主要是基于以下认识。

本发明将分离自兰科植物菌根的兰科丝核菌与春剑根状茎的组织匀浆物混合做为接种剂，把春剑蒴果内成熟种子播于接种剂上萌发，建立菌植共生体系，获得春剑幼苗，从而实现了本发明的目的。

一种拟野生兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法，包括以下步骤：

(1) 兰科丝核菌培养：将冷冻保藏于试管斜面上的兰科丝核菌活化后接于PAD培养基平板上，在恒温培养箱中25℃倒置培养10天；用打孔器打出直径为5mm的菌丝块备用；

(2)接种剂准备：剪取健康完整的春剑肉质根经表面消毒后，与去离子水1：0.5（质量比)混合打成组织匀浆物后，接种直径为5mm的菌丝块，28℃暗培养7天作为接种剂备用；

(3)蒴果表面消毒：用70%的酒精棉花擦拭蒴果外部后，将整个蒴果浸入加有少数展著剂的1.0%次氯酸钠溶液中消毒10min后备用；

(4)混合接种：将表面灭菌后的蒴果，放在培养皿中以4号解剖刀将蒴果纵切开，并刮出种胚。用长镊子夹住蒴果中的棉絮状胎座束，在准备好的接种剂上来回轻扫，把种胚均匀播在接种剂上，然后将播有种胚的接种剂均匀撒在装有新鲜苔藓的育苗盘上；

(5)共生体系培养：将接种后的育苗盘，放入自然环境中培养，培养条件为：自然光照，自然温度，苔藓湿度控制在75-85%，苔藓保持浅绿色缓慢生长；

(6)共生体系镜检：获得完整的春剑幼苗后，用水洗净并剪取基部根段，滤纸吸干多余水分，用刀片拉片成薄且透明的切片，在显微镜下观察。同种横向切开根段，切面朝上，粘于铜面上后放置在扫描电子显微镜下观察并照像。可观察到根内有典型兰科丝核菌特征，表明共生培养成功；