[发明专利]一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法

摘要

本发明公开了一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法。所述检测方法包括如下步骤：(1)配制含有目标物的标准溶液；(2)将辅助探针固定于玻片上，加入核酸适配体，辅助探针与核酸适配体杂交；(3)向玻片上加入标准溶液，目标物与核酸适配体结合使其从辅助探针上脱离；(4)向玻片上加入信号探针，信号探针与被释放的辅助探针发生短暂杂交；(5)将玻片置于全内反射荧光显微镜的载物台上进行检测，记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，以其为纵坐标，以标准溶液中目标物浓度为横坐标制作标准曲线；(6)将待测样品重复步骤(3)‑(5)，记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，根据标准曲线即得待测样品中目标物的浓度。

主权项

1.一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法，包括如下步骤：（1）配制至少3种含有目标物的标准溶液；所述标准溶液中，所述目标物的浓度为0~5000 fM；（2）将辅助探针固定于玻片上，并加入核酸适配体，所述辅助探针与所述核酸适配体杂交；所述核酸适配体与所述辅助探针之间互补的碱基数为13~15个；所述杂交的条件如下：温度为20~27℃，时间为10~30分钟；所述辅助探针与所述玻片之间通过生物素‑亲和素的相互作用连接；所述辅助探针上标记生物素；所述玻片上修饰亲和素；（3）向所述玻片上加入所述标准溶液，所述目标物与所述核酸适配体结合使其从所述辅助探针上脱离；所述目标物与所述核酸适配体结合的条件如下：温度为20~27℃，反应时间为60~120min；（4）向所述玻片上加入信号探针，所述信号探针与步骤（3）中被释放的所述辅助探针发生短暂杂交；所述信号探针与所述辅助探针之间互补的碱基个数为9~10个；所述信号探针的5’端标记Cy3荧光基团；（5）将所述玻片置于全内反射荧光显微镜的载物台上进行检测，记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，以所述标准溶液中所述目标物的浓度为横坐标，以荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数为纵坐标，制作标准曲线；所述检测的时间至少为10min；（6）将待测样品重复步骤（3）‑（5），记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，根据所述标准曲线，即得到所述待测样品中所述目标物的浓度；所述信号探针与所述辅助探针之间存在的部分互补序列少于所述辅助探针与所述核酸适配体之间存在的部分互补序列；所述待测样品为鲜活农产品；所述目标物为啶虫脒时，所述辅助探针的序列为：5’‑Biotin‑TTTTTTTTTTTCTTCATAATATGGTG‑3’，所述核酸适配体的序列为：5’‑TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA‑3’，所述信号探针的序列为：5’‑Cy3‑ATTATGAAGA‑3’；所述目标物为多氯联苯时，所述辅助探针的序列为：5’‑Biotin‑TTTTTTTTTTCTTCGTAGCCCCGCC‑3’，所述核酸适配体的序列为：5’‑GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG‑3’，所述号探针的序列为：5’‑Cy3‑GGGCTACGAA‑3’。