[发明专利]一种淡水鱼类筛选微卫星序列的方法

摘要

本发明具体涉及在淡水鱼类中进行微卫星序列的分离及筛选方法。属于DNA分子标记技术。本发明采用磁珠富集法筛选微卫星序列，能够简单、快速的筛选出多数淡水鱼类整个基因组中的微卫星序列，在短时间内开发大量的微卫星引物。建立淡水鱼类微卫星DNA技术体系，使这些分子标记应用于在鱼类种质资源鉴定，遗传育种的研究。

主权项

一种淡水鱼类筛选微卫星序列的方法，其步骤包括：（1）鱼类肌肉DNA的提取；（2）用MboⅠ酶切基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳，切下300‑800bpDNA片段的凝胶，回收；（3）酶切片段与Sau LA /Sau LB 接头连接，接头序列为：Oligo A：5＇‑GGCCACAGACCCCACGCATCG‑3＇ (SEQ ID NO.1)和Oligo B：5＇‑PO4‑ GATACGAAGCTTGGGCTCTCTCG CC‑ 3＇(SEQ ID NO.2)；（4）采用磁珠，选择AGC、ACAG、ATCT重复序列的探针进行富集微卫星序列，获得富含SSR重复的单核苷酸序列；（5）以Sau3AL为引物，PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段；（6）将PCR扩增的纯化产物与pGEM‑TEasy载体(Promega)连接，克隆转化；（7）含有微卫星序列阳性克隆的PCR法筛选，菌落PCR产物能给出两条或者以上的条带，说明这个单克隆含有目的序列，反之则没有；（8）序列分析，利用DNA star软件编辑序列，先去除载体序列得的基因组序列，利用SSRhunte找出含有微卫星的序列。