[发明专利]高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用

摘要

高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用，包装质粒和膜囊质粒，所述包装质粒为pMDLg/pRRE、pRSV‑Rev，囊膜质粒为VSV‑G，用于细胞转染的Buffer A:1M CaCl₂，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B：1M NaHCO₃，重悬病毒时减少病毒黏附损失的Buffer C：302无血清培养基。利用4质粒表达系统共转染HEK 293T细胞，收集病毒上清，超速离心后获得滴度高达10¹⁰ TU/mL的病毒浓缩液，用其感染小鼠腹腔巨噬细胞两次，可达90%以上的感染效率。

主权项

1.高滴度慢病毒的制备试剂盒的应用，其特征在于包装质粒和膜囊质粒，所述包装质粒为pMDLg/pRRE、pRSV‑Rev，囊膜质粒为VSV‑G，用于细胞转染的Buffer A :1M CaCl2，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B：1M NaHCO3，重悬病毒时减少病毒黏附损失的Buffer C：302无血清培养基；具体应用步骤为：（1）转染：细胞转染前24小时，用0.25%Trypsin‑EDTA将长满15cm细胞培养皿的转染细胞进行消化，按1:10细胞数量传代至直径10cm细胞培养皿，每份培养皿加入10mL DMEM+10%FBS+1%PS培养基，第二天细胞汇合度达到80%以上；所述转染细胞为HEK 293T细胞；（2）转染前1小时，弃掉原培养基，每份直径10cm细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的6mL DMEM+10% FBS培养基；（3）病毒包装液的准备：将试剂盒中的质粒混合物60μL与转移质粒 60μg分别加入到6mL无酚红DMEM培养基中并混匀，所述质粒混合物为包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV‑Rev与囊膜质粒VSV‑G按质量比1:1:1的混合物，加入试剂Buffer A 360μL，混匀，室温静置20~30分钟，每份培养皿中均匀滴入1mL病毒包装液，十字晃匀，置于37℃孵箱；（4）18小时后，吸出全部的病毒包装液至预先准备的84消毒液中，每份细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的12mL DMEM+10% FBS+1%Buffer B培养基；（5）48~72小时后，收集上清，初步离心，3000rpm，5分钟；（6）准备0.45μm孔径滤器，用PBS+1% Buffer C 润湿；（7）将离心后的病毒上清通过湿润的0.45μm孔径滤器过滤，以去除细胞碎片；（8）将过滤后的病毒液体进行超速离心，18000rpm，2小时，4℃；（9）离心后弃上清，用200μL PBS+1% Buffer C重悬，分装后于‑80℃冰箱保存备用。