[发明专利]一种男性血源性自体精原干细胞的制备方法和试剂盒及应用

摘要

本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种使男性的血液细胞逆向分化产生血源性自体精原干细胞的制备方法、干细胞及其应用。所述的制备方法通过将自体细胞作为原料细胞依次经细胞培养液S1、细胞培养液S2和细胞培养液S3培养后得到血源性自体精原干细胞。本发明应用人自体血液细胞作为更方便更简易的逆向分化生产人自体精原干细胞的自体原料细胞。本发明应用小分子物质组成的细胞培养液配方，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，快速使人的自体血液细胞逆向分化产生人血源性精原干细胞。本发明在男性血源性自体精原干细胞的生产速度、产量、纯度方面均明显优于现有技术。

主权项

一种男性血源性自体精原干细胞的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：(1)将自体来源的细胞作为原料细胞以1×106～5×106的密度接种于细胞培养皿中；(2)在37℃和5％的CO2的环境中，将原料细胞在细胞培养液S1中培养3天，得到细胞1；所述的细胞培养液S1为含有以下成分的RPMI 1640培养液：2～10％的Knockout血清替代品、1～1000ng/mL的促红细胞生成素、1～1000ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子、1～1000ng/mL的粒细胞集落刺激因子、1～1000ng/mL的白细胞介素‑3、1～1000ng/mL的白细胞介素‑6、1～1000ng/mL的干细胞因子、1～1000ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、1～1000ng/mL的Nanog蛋白、1～1000ng/mL的Oct4蛋白、1～1000ng/mL的Sox2蛋白和1～1000ng/mL的C‑myc蛋白；(3)在37℃和5％的CO2的环境中，将步骤(2)得到的细胞1再于细胞培养液S2中培养3～6天，得到细胞2；所述的细胞培养液S2为含有以下成分的M2培养液：2～10％的Knockout血清替代品、1～1000ng/mL的Nanog蛋白、1～1000ng/mL的Oct4蛋白、1～1000ng/mL的Sox2蛋白、1～1000ng/mL的C‑myc蛋白、1～1000ng/mL的生殖细胞特异性蛋白DDX4/MVH、1～1000ng/mL的Dazl蛋白、1～1000ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、1～1000ng/mL的表皮细胞生长因子、1～1000ng/mL的白细胞介素‑6、1～1000ng/mL Sox17蛋白、1～1000ng/mL的VASA蛋白、1～1000ng/mL的干细胞因子和1～1000ng/mL的粒细胞集落刺激因子；(4)在37℃和5％的CO2的环境中，将步骤(3)得到的细胞2再于细胞培养液S3中培养3～6天，得到细胞3，所述的细胞培养液S3为含有以下成分的M16培养液：2～10％的Knockout血清替代品、1～1000μM的烟酸、1～1000ng/mL的DMC1蛋白、1～1000ng/mL的PRDM1蛋白、1～1000ng/mL的磷酸甘油酸酯激酶2、1～1000ng/mL的睾酮、1～1000ng/mL的卵泡刺激素、1～1000ng/mL的生殖细胞特异性蛋白DDX4/MVH、1～1000ng/mL的Dazl蛋白、1～1000ng/mL的Oct4蛋白、1～1000ng/mL Sox17蛋白、1～1000ng/mL的VASA蛋白、1～1000ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、1～1000ng/mL的成纤维细胞生长因子2、1～1000ng/mL的成纤维细胞生长因子7、1～1000ng/mL的骨形态发生蛋白2、1～1000ng/mL的骨形态发生蛋白4、1～1000ng/mL的白细胞介素‑6、1～1000ng/mL的神经营养因子4、1～1000ng/mL的胶质细胞源性神经营养因子、1～1000ng/mL的活化素A、1～1000ng/mL的泛酸、1～1000ng/mL的17α,20β‑双羟孕酮、1～1000ng/mL的AY9944‑A‑7、1～1000ng/mL的表皮细胞生长因子、1～1000ng/mL的血管内皮生长因子、1～1000ng/mL的干细胞因子、1～1000ng/mL的胰岛素样生长因子I、1～1000ng/mL的胰岛素样生长因子II、1～1000ng/mL的生长激素释放因子、1～1000ng/mL的Ifitm3蛋白、1～1000ng/mL的生长激素、1～1000ng/mL的地塞米松和1～1000ng/mL的粒细胞集落刺激因子；(5)轻轻吹打依次在细胞培养液S1、细胞培养液S2及细胞培养液S3中培养后得到的细胞3，使细胞3完全悬浮后，收集细胞3于离心管中，进行离心操作，然后使用生理盐水对悬浮的细胞3进行清洗操作，重复清洗操作3次后，将细胞3悬浮于生理盐水中，即得到男性血源性自体精原干细胞。