[发明专利]利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法

摘要

本发明涉及药物化学领域，具体公开了一种利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法。该方法先成功构建并原核表达纯化得到纯度较高的GST‑Dcn1重组蛋白，合成UBC12 N末端乙酰化修饰的1‑12个氨基酸序列作为底物。用分子间相互作用确定UBC12和Dcn1有活性并且能相互作用；然后再利用HTRF技术建立优化的UBC12/Dcn1活性测定平台。该反应体系稳定，可耐受较宽的pH范围(5.5‑8.0)及二价金属离子、螯合物等；背景低，受到样品的干扰非常少，假阳性假阴性均低，可去除天然产物自发荧光的干扰，灵敏度高；易于实现微型化，通量高。

主权项

利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：(1)GST‑Dcn1重组蛋白的表达纯化（a）GST‑Dcn1表达载体的构建：选择表达载体PGEX‑4T‑1及目的基因活性片段GST‑Dcn1，将其克隆到表达载体上;(b) GST‑Dcn1重组蛋白的表达：将步骤（a）构建成功的目的载体转化进入BL21(DE3)表达菌株中，将菌液均匀涂布到混有抗生素的固体培养基上，挑单克隆筛选出含有目的质粒的菌株进行培养：表达蛋白时先将目的菌株接种到液体培养基中37℃进行扩大培养，待菌处于生长期OD 0.6‑0.9时加入异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导目的蛋白的表达；所述抗生素选氨苄青霉素，终浓度100µg/ml ；(c) GST‑Dcn1重组蛋白的纯化：离心收集步骤（b）菌液中的菌体，然后超声破碎释放目的蛋白，高速离心弃去菌体碎片，得到目的蛋白溶液;根据构建表达载体时选择的载体特征选择合适的纯化柱、纯化条件、缓冲液纯化收集蛋白样品；(d) 表达纯化结果：取步骤（c）蛋白纯化时收集的蛋白样品，加入蛋白loading buffer 变性，然后SDS‑PAGE胶电泳，用考马斯亮蓝染液染胶，在目的蛋白大小处有蛋白条带;(2)HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂平台的建立根据HTRF方法特征选择检测试剂，缓冲溶液中，检测UBC12和Dcn1的相互作用；通过发射波长665nm时的信号值与620nm时信号值的比值判断两种生物分子相互作用的强度，从而筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂。