[发明专利]检测CPV2a、CPV2b与CPV2c并鉴别野生型与疫苗型的方法

摘要

本发明提供一种检测CPV2a、CPV2b与CPV2c并鉴别野生型与疫苗型的方法。本发明提供一种检测犬细小病毒2a(CPV2a)、犬细小病毒2b(CPV2b)与犬细小病毒2c(CPV2c)的结构性蛋白VP2的方法，其中可利用荧光侦测系统及侧流式免疫分析侦测信号。本发明另提供一种区分野生型与疫苗型的方法，该方法的第一种手段是利用荧光侦测系统及侧流式免疫分析进行SNP 36的分析，第二种手段则是进行SNP 899及SNP 963的分析。

主权项

1.一种检测样本内包含犬细小病毒2a、犬细小病毒2b或犬细小病毒2c的结构性蛋白VP2核酸的目标核酸的方法，其特征在于包含：

(a)提供样本，其包含CPV2a、CPV2b或CPV2c的目标核酸；

(b)提供引物对，该引物对包含第一引物与第二引物，第一引物是由选自于SEQ ID No.2所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，第二引物是由选自于SEQ ID No.3所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；

(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；

(d)黏合探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中探针的序列是选自于由SEQ ID No.4至6组成的群组；以及

(e)检测杂交体产生的信号，以判定样本中包含有目标核酸。

2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物及/或所述探针包含修饰后核酸或非核酸化合物。

3.依据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述杂交体产生的信号包含荧光信号。

4.依据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述探针的5’端具有荧光报导子，该荧光报导子是选自由FAM、HEX、VIC、CY5及TET组成的群组，所述探针的3’端具有荧光淬灭子，该荧光淬灭子是选自由TMARA、MGB及BHQ组成的群组。

5.依据权利要求4所述的方法，其特征在于，出现荧光信号表示样本中具有目标核酸，未出现荧光信号表示样本中不具有目标核酸。

6.依据权利要求5所述的方法，其特征在于，通过DNA依赖性聚合酶的外切核酸酶水解，将荧光报告物的片段自与目标核酸杂交的探针上切割下来，并通过荧光报告物的片段数量来侦测荧光信号。

7.依据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述信号包含分析物，该分析物在经侧流免疫分析后为肉眼可见的有色颗粒。

8.依据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一引物或第二引物的5’端带有一抗原，该抗原是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas‑red及Tamra组成的群组，所述探针的3’端具有另一抗原，该另一抗原是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas‑red及Tamra组成的群组。

9.依据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述有色颗粒是选自由胶体金、乳胶及纳米碳粒组成的群组。

10.依据权利要求9所述的方法，其特征在于，出现分析物信号表示样本中具有目标核酸，未出现分析物信号表示样本中不具有目标核酸。

11.一种鉴别样本内目标核酸为犬细小病毒野生型或疫苗型的方法，其特征在于包含：

(a)提供样本；

(b)提供引物对，该引物对包含第一引物与第二引物，第一引物是由选自于SEQ ID No.7所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，第二引物是由选自于SEQ ID No.11、12或13所示互补核酸序列的至少12个连续的核酸序列所组成；

(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；

(d)黏合SNP探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中SNP探针对于CPV2a、CPV2b与CPV2c的结构性蛋白VP2的基因的SNP 36具特异性，且SNP探针的序列包含SEQ ID No.14或15；以及

(e)侦测杂交体产生的信号，以判定样本中包含有目标核酸。

12.依据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一引物是选自于由SEQ ID No.8至10所组成的群组。

13.依据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述引物及/或所述SNP探针包含修饰后核酸或非核酸化合物。

14.依据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述杂交体产生的信号包含荧光信号。

15.依据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述SNP探针的5’端具有荧光报导子，该荧光报导子是选自由FAM、HEX、VIC、红光CY5及TET组成的群组，所述SNP探针的3’端具有荧光淬灭子，该荧光淬灭子是选自由TMARA、MGB及BHQ组成的群组。

16.依据权利要求15所述的方法，其特征在于，出现荧光信号表示为野生型，未出现荧光信号表示为疫苗型。

17.依据权利要求16所述的方法，其特征在于，通过DNA依赖性聚合酶的外切核酸酶水解，将荧光报告物的片段自与目标核酸杂交的探针上切割下来，并通过荧光报告物的片段数量来侦测荧光信号。

18.依据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述疫苗型是指样本曾经接种过任一疫苗，该疫苗是选自由Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II‑SL、Eurican5及Virbagen DA2Parvo组成群组中的一个。

19.依据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述信号包含分析物，该分析物在经侧流式免疫分析后为肉眼可见的有色颗粒。

20.依据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第一引物或第二引物的5’端具有一抗原，该抗原是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas‑red及Tamra组成的群组，所述SNP探针的3’端具有另一抗原，该另一抗原是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas‑red及Tamra组成的群组。

21.依据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述有色颗粒是选自由乳胶金、乳胶及纳米碳粒组成的群组。

22.依据权利要求21所述的方法，其特征在于，出现分析物信号表示样本中具有目标核酸，未出现分析物信号表示样本中不具有目标核酸。

23.一种鉴别样本内目标为犬细小病毒野生型或疫苗型的方法，其特征在于包含：

(a)提供样本；

(b)提供引物对，该引物对包含第一引物与第二引物，第一引物是由选自于SEQ ID No.16所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，第二引物是由12个选自于SEQ ID No.22或23所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；

(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标；

(d)黏合P1探针与P2探针至目标核酸，以在进行步骤(c)时形成杂交体，其中P1探针对CPV2a、CPV2b与CPV2c的结构性蛋白VP2基因的SNP 899具特异性，P2探针对CPV2a、CPV2b与CPV2c的VP2基因的SNP 963具特异性，且P1探针包含选自由SEQ ID No.24至27组成的群组，P2探针包含选自由SEQ ID No.29至33组成的群组；以及

(e)侦测杂交体产生两种不同的荧光信号。

24.依据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一引物是选自于由SEQ ID No.17至21所组成的群组。

25.依据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述P1探针及P2探针的5’端各具有荧光报导子，各荧光报导子是选自由FAM、HEX、VIC、CY5及TET组成的群组且彼此不相同，所述P1探针及P2探针的3’端各具有荧光淬灭子，各荧光淬灭子是选自由TMARA、MGB及BHQ组成的群组。