[发明专利]一种精确定量HIV DNA的检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明的公开了一种联合多种PCR精确定量HIV DNA的检测方法，具体地，本发明将巢式PCR、实时荧光定量PCR和Digital PCR联合应用以精确定量HIVDNA，通过三种PCR方法的结合，设计特异的针对HIV各个亚型的特异引物，达到对HIV DNA进行了精准定量和节约成本的目的。另外，本发明根据上述检测方法开发了精确定量HIV DNA的检测试剂盒，该试剂盒在临床上具有广泛的应用前景。

主权项

1.一种非诊疗目的的精确定量HIV DNA的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）利用巢式PCR对样本进行特异性扩增以鉴定HIV DNA的有无；（2）将巢式PCR阳性样本进行实时荧光定量PCR以确定 HIV DNA量和亚型；（3）将巢式PCR阳性、实时定量PCR阴性的样本进行Digital PCR定量HIV DNA拷贝数；所述巢式PCR使用两组引物进行两轮PCR，每组引物包括外套和内套两对引物；第一组引物中，所述外套引物中上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述外套引物中下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，所述内套引物中上游引物是SEQ ID NO.3所示的引物和SEQ ID NO.4所示的引物的混合，所述内套引物中下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；第二组引物中，所述外套引物中上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，所述外套引物中下游引物是SEQ ID NO.7所示的引物和SEQ ID NO.8所示的引物的混合，所述内套引物中上游引物是SEQ ID NO.9所示的引物和SEQ ID NO.10所示的引物的混合，所述内套引物中下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.11所示；所述实时荧光定量PCR使用针对HIV不同亚型的DNA序列设计亚型特异性引物，其中，针对HIV的AE亚型设计的引物序列为：上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID NO.18所示；针对HIV的BC亚型设计的引物序列为：上游引物是SEQ ID NO.19所示的引物和SEQ ID NO.20所示的引物的混合，下游引物序列如SEQ ID NO.21所示；针对HIV的B亚型设计的引物序列为：上游引物序列如SEQ ID NO.22所示，下游引物是SEQ ID NO.23所示的引物和SEQ ID NO.24所示的引物的混合；所述Digital PCR使用HIV DNA的通用扩增引物，其中，上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID NO.16所示。