[发明专利]一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法

摘要

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法，方法通过(1)富血小板纤维蛋白胶的提取、(2)特殊完全培养基的配制、(3)原代脂肪间充质干细胞的分离培养与传代培养和(4)不同类型脂肪间充质干细胞扩增后的生物学特征四个步骤完成。本发明获取了一种高纯度的CD54(+)脂肪间充质干细胞群，这群细胞具有较强的克隆形成能力、自我更新能力和成脂分化潜能，为在体外获取大量的具有干性的种子细胞运用于脂肪组织再生提供了新的方法，对提高临床上软组织损伤修复或先天性体表器官软组织缺陷畸形提供一种新的治疗策略，同时，也为确保其将来在临床应用的安全性提供充分的理论依据。

主权项

一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)富血小板纤维蛋白胶的提取抽取患者50～100ml的静脉血，分装于无菌负压试血管内，采用转速2700rpm/min高速离心机离心，离心时间为12min，提取富含细胞因子的凝胶状物质，静置5min，即可得到富血小板纤维蛋白凝胶，此时血液分3层：最上层是贫血小板血浆，为淡黄色透明清亮液体；中间层是富血小板纤维蛋白，为淡黄色凝胶状物质；最下层是红细胞碎片，为暗红色物质；排出其中多余的红细胞，将富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆一起加入含体积分数100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，放置于4℃冰箱储存备用，7d后采用酶联免疫吸附试验检测培养基中各种细胞因子的浓度显示，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子‑β1、表皮生长因子、白细胞介素‑4、白细胞介素‑6、基质金属蛋白酶‑1和胰岛素样生长因子‑1的浓度峰值在提取后第7d，之后呈缓慢下降，但储存28d时仍保持较高的细胞因子水平；(2)特殊完全培养基的配制DMEM高糖培养基500ml+100ml静脉血分离提取的富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆+1％青霉素、链霉素，4℃保存备用；(3)原代脂肪间充质干细胞的分离培养与传代培养在患者大腿上段内外侧或下腹部，采用低负压抽取脂肪组织50ml，采用转速为600rpm/min离心机离心，离心时间为2min，用0.1％的Ⅰ型胶原酶恒温消化40～50min，以步骤(2)等量的特殊完全培养基中和后采用转速为1300rpm/min离心机离心、离心时间为5min，去除杂质及上清，沉淀混悬后用200目尼龙网过滤，再用特殊完全培养基将细胞混悬，按1×105/ml接种于25cm2的培养瓶中，置于体积浓度为5％CO2中饱和湿度、在37℃恒温培养箱进行单层细胞培养，24～48h后更换培养液一次，以后每3～4d换液1次并动态观察细胞的生长特性，7～10d细胞生长融合达80％～90％后，此时细胞称为原代脂肪间充质干细胞记为ASCs‑P0，经0.25％胰酶消化，按1∶3进行传代培养，第一代细胞记为ASCs‑P1。选取生长良好的ASCs‑P1代细胞进行流式细胞术检测CD29、CD44、CD45、CD49d、CD54、CD105、CD106表面分子阳性细胞数，同时用免疫磁珠分选法将ASCs‑P1进行分选，获取CD54(+)ASCs‑P1，将获得的CD54(+)ASCs‑P1用特殊完全培养基培养并进行继续传代扩增，将CD54(+)ASCs‑P3、CD54(+)ASCs‑P10分别与胶原蛋白海绵支架形成复合物，在成脂诱导培养基中体外培养至7d，取出材料，用2.5％戊二醛固定，用梯度酒精脱水，临界点干燥，横截面表面喷金，扫描电镜观察；选取生长良好的CD54(+)ASCs‑P3、CD54(+)ASCs‑P10代细胞及CD54(‑)ASCs‑P3、CD54(‑)ASCs‑P10进行常规成脂分化诱导培养14d，比较各组细胞的体外成脂分化能力；(4)不同类型脂肪间充质干细胞扩增后的生物学特征原代脂肪间充质干细胞在接种后24h内贴壁，细胞的形态为短梭形或三角形，在特殊完全培养基培养过程中，脂肪间充质干细胞呈现克隆样生长，且7～10d细胞克隆数迅速增多并形成致密细胞群，细胞呈方向性排列，传代后仍可见脂肪间充质干细胞呈现克隆样迅速生长并均匀分布；脂肪间充质干细胞在特殊完全培养基培养过程中生长状态非常活跃，在第10代体外扩增的过程中，增殖速率基本稳定，细胞形态为长梭形，生长过程中基本保持不变，第10代脂肪间充质干细胞仍具有旺盛的增殖能力，实验结果表明，使用特殊完全培养基，取材20ml脂肪组织分离的脂肪间充质干细胞经过3周左右的体外扩增，细胞总数可达到1×108以上；第1代脂肪间充质干细胞未经免疫磁珠筛选前成脂诱导14d，可见细胞内有透亮的脂滴形成，油红O染色可见脂滴被染成鲜红色；成骨诱导21d后，可见典型的矿化钙结节形成，茜素红染色呈鲜红色；成软骨诱导14d后，可见高度聚集样生长的细胞团，呈斑片状或结节状，周围细胞呈放射状，结节较大，肉眼可见，阿利辛蓝染色提示结节及周边聚集的细胞呈蓝色；第1代脂肪间充质干细胞进行流式细胞术检测结果显示CD29、CD44、CD49d、CD54、CD105表面分子均为阳表达，而CD45和CD106为阴性如表1所示；CD54(+)ASCs‑P3、CD54(+)ASCs‑P10成脂诱导培养7d后，扫描电镜下观察显示，脂肪间充质干细胞在支架材料表面及内部孔壁伸展、黏附，细胞表面有脂滴附着，细胞形态多为偏圆形、长梭形或不规则状铺开，细胞数量逐渐增多，呈聚集性分布，细胞周围有大量基质，说明胶原支架与细胞有着非常良好的生物相容性，极利于细胞的生长增殖；CD54(+)ASCs‑P3、CD54(+)ASCs‑P10脂肪间充质干细胞成脂诱导启动后，细胞增殖速度减缓，细胞体积逐渐变大，7d左右胞浆内出现大小不等的空泡和脂滴，并逐步相互融合，形成较大脂滴；诱导14d时，细胞分化达到高峰，细胞内脂滴经油红O染色后，显示为红色液滴，二者在形态上无显著差别；而CD54(‑)ASCs‑P3、CD54(‑)ASCs‑P10成脂诱导后，细胞体积巨大，形态发生变化，呈多边形，且只有少数细胞内出现红染液滴，与前者形成鲜明对比；CD54(+)ASCs‑P3、CD54(+)ASCs‑P10两组成熟脂肪细胞密度、细胞内脂滴含量检测、成脂相关基因及蛋白表达均显著高于CD54(‑)ASCs‑P3、CD54(‑)ASCs‑P10两组。