[发明专利]白色念珠菌场发射扫描电子显微镜样品的快速制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体为白色念珠菌场发射扫描电子显微镜样品的快速制备方法，白色念珠菌菌体加入到戊二醛固定液固定，采用无菌去离子水清冼，不同浓度梯度的叔丁醇脱水，菌液滴入到纯叔丁醇中在4℃冰箱冷冻，干燥后的样品用离子溅射喷金后，调整并设置参数即可进行扫描电镜来观察菌体生物膜的形态结构。本发明提供的白色念珠菌场发射扫描电子显微镜样品的快速制备方法，减少白色念珠菌的分泌物干扰样品的成像质量；尽量消除磷酸盐颗粒将部分样品覆盖并遮蔽的现象；降低样品出现微小的形变和避免生物膜小部分脱落；避免菌体生物膜表面龟裂或不同程度皱缩凹陷甚至是断裂，同时消除对菌体表面损伤。

主权项

白色念珠菌场发射扫描电子显微镜样品的快速制备方法，包括以下过程：将冷藏存于4℃冰箱中固体斜面上的白色念珠菌菌株挑出后，在超净工作台里接种于固体马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，划线并培养于30℃的恒温培养箱中培养12h后，挑取培养皿上单菌落至液体普通肉汤培养基里于30℃的空气浴振荡器中以200rpm培养12～24h，得到白色念珠菌菌悬液；其特征在于，将白色念珠菌菌悬液以8000rpm离心3～5min后，弃掉上清液，获得白色念珠菌菌体进行以下操作：(1)将白色念珠菌菌体加入到2.5％戊二醛固定液中于4℃冰箱单固定4h；(2)采用无菌去离子水清冼2～3次；(3)不同浓度梯度的叔丁醇脱水，叔丁醇质量浓度依次为30％、50％、70％、85％、95％，各1次，5min/次，然后用100％叔丁醇脱水2次，15min/次，其中：每次脱水后均需以8000rpm、3～5min离心弃掉上清液；再转入至下一种试剂，每次用移液枪吹打3～5次，打散菌块；(4)真空干燥：将离心浓缩后的菌液滴入到纯叔丁醇中在4℃冰箱冷冻10min后，放入至真空干燥箱内干燥；(5)离子溅射喷金：待干燥后的样品温度升到室温后取出倒入至培养皿，轻摇分散菌体；采用碳导电胶带一面粘在盖玻片上，另一面倒扣轻压在菌体粉末上，翻正后用镊子将菌体刮薄铺平；离子溅射喷金后，调整并设置参数即可进行扫描电镜来观察菌体生物膜的形态结构。