[发明专利]含人间充质干细胞外泌体提取物的矽肺病治疗雾化剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种含人间充质干细胞外泌体提取物的矽肺病治疗雾化剂及其制备方法，其中主要成分为高浓度的间充质干细胞外泌体提取物。间充质干细胞在培养过程中会分泌多种细胞因子，这些细胞因子能够深入内膜基底层，促进内膜组织分化、血管新生、肉芽组织生长，促使损伤皮肤组织结构再生修复，减少疤痕结缔组织的产生，减少创面组织的细菌感染及炎症反应。本发明采用连续饥饿间充质干细胞的方法,在较短时间内就能得到高浓度的人间充质提取物，通过外泌体提取器从中分离出大量干细胞外泌体。本发明含高浓度间充质干细胞外泌体提取物的雾化剂适用于矽肺病的修复及治疗。

主权项

一种含人间充质干细胞外泌体提取物的矽肺病治疗雾化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取P2‑P6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％‑60％、35％‑45％、20％‑30％；培养细胞所用完全培养基为无酚红DMEM/DF12和体积比浓度为10％胎牛血清；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；(2)第一批次细胞融合度达到70％‑80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；(3)饥饿培养12‑24小时后，第一批次细胞融合度达90％‑95％，收取细胞培养上清，3000‑4500g条件下离心5‑8min除去沉淀，取离心后上清备用；(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％‑80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；(5)饥饿培养12‑24小时后，第二批次细胞融合度达90％‑95％，收取细胞培养上清，3000‑4500g条件下离心5‑8min除去沉淀，取离心后上清备用；(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％‑80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；(7)饥饿培养12‑24小时后，第三批次细胞融合度达90％‑95％，收取细胞培养上清，3000‑4500g条件下离心5‑8min除去沉淀，取离心后上清备用；(8)连续饥饿三次后将收集的步骤(7)上清以0.22um滤膜过滤，提取其中的干细胞外泌体，以20‑40ml的生理盐水重悬分离获得的外泌体制备成雾化剂，放于4℃冰箱中保存。