[发明专利]制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法

摘要

本发明公开了一种用酵母菌制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法。本发明提供的方法包括以下步骤：1)将编码埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体；所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体为将保留有埃博拉病毒糖蛋白受体结合区与聚糖帽区的埃博拉病毒糖蛋白核心区融合至埃博拉病毒基质蛋白的N末端后得到的重组蛋白。本发明制备的埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体具有聚体结构且拥有糖基化修饰，因而其具有作为埃博拉出血热预防用疫苗的潜质。

主权项

1.一种制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法，包括如下步骤：/n（1）将编码埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；/n（2）对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体；/n所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体为将保留有埃博拉病毒糖蛋白受体结合区与聚糖帽区的埃博拉病毒糖蛋白核心区融合至埃博拉病毒基质蛋白的N末端后得到的重组蛋白；/n步骤（1）中，编码所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的基因为如下（b1）-（b4）中任一所示DNA分子：/n（b1）序列表中序列7的第1-1950位所示DNA分子；/n（b2）序列表中序列7的第97-1950位所示DNA分子；/n（b3）序列表中序列7的第1-1911位所示DNA分子；/n（b4）序列表中序列7的第97-1911位所示DNA分子；/n步骤（2）中，进行所述破碎的方法为高压均质仪以600bar 的压力匀浆3次；/n在步骤（2）中，进行所述破碎后还包括向破碎后的体系中加入终浓度为如下的各物质：8M 尿素、50mM pH8.0的磷酸盐缓冲液、500mM NaCl、10mM咪唑和体积百分含量为5%的甘油，获得含有所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白的粗提液的步骤：/n在步骤（2）中，还包括对所述粗提液进行纯化的步骤；/n所述纯化为对所述粗提液依次进行亲和层析、凝胶排阻层析和离子交换层析；/n进行所述亲和层析时，采用的介质为Chelating Fast Flow；采用的柱平衡液记为A液，所述A液组成如下：6M 尿素、500mM NaCl、50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液、10mM咪唑和体积百分含量为5%的甘油，余量为水；采用的洗脱液记为B液，所述B液组成如下：6M 尿素、500mMNaCl、50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液、500mM咪唑和体积百分含量为5%的甘油，余量为水；所用洗脱梯度为：（1）5%所述B液和95%所述A液，（2）50%所述B液和50%所述A液，（3）100%所述B液，%表示体积百分含量；所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白存在于所述“（2）50%所述B液和50%所述A液”的洗脱液中；/n进行所述凝胶排阻层析时，采用的介质为Sephadex G25；采用的流动相组成如下：20mMpH6.5的磷酸盐缓冲液、6M 尿素、体积百分含量为5%的甘油，余量为水；/n进行的所述离子交换层析为阳离子交换层析，所采用的介质为SOURCE 30S；采用的平衡液记为A’液，所述A’液组成如下：20mM pH6.5的磷酸盐缓冲液、6M 尿素、体积百分含量为5%的甘油，余量为水；采用的洗脱液记为B’液，所述B’液组成如下：20mM pH6.5的磷酸盐缓冲液、6M 尿素、体积百分含量为5%的甘油，和1M NaCl，余量为水；所用洗脱梯度为：（1）15%所述B’液和85%所述A’液，（2）30%所述B’液和70%所述A’液，（3）50%所述B’液和50%所述A’液，（4）100% 所述B’液，（5）100% 0.5M NaOH，%表示体积百分含量；所述埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体蛋白存在于所述“（1）15%所述B’液和85%所述A’液”的洗脱液中。/n