[发明专利]一种检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统及其应用

摘要

本发明公开了一种检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统,采用以下步骤制备一、制作从入口处分为2条以上平行的微流体信道，微流体信道内设置有若干个鱼骨结构的PDMS微流体管道系统；二、硅纳米线基底的刻蚀；三、硅纳米线的表面修饰和生物素生物功能化、四、硅纳米线基底的修饰和PDMS微流体芯片的组装。该系统在使用时将待测样本细胞与生物素修饰的p‑EpCAM和p‑cKit的200μL PBS溶液共孵育1小时，然后注射进入微流体系统内进行检测。本发明的微流体系统可以识别和结合出含量极低的CTC，可以进行传统的免疫荧光染色，得到检出结果和表型分析结果，也可以进一步特异性释放，实现CTC的纯化，提高纯度以适应基因检测限度的要求。

主权项

一种检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统,其特征在于，采用以下步骤制备：一、PDMS微流体芯片的制作PDMS微流体管道系统包括一个入口和一个出口，从入口处分为2条以上平行的微流体信道，微流体信道内设置有若干个鱼骨结构，在入口和出口处均设置有PDMS孔洞；二、硅纳米线基底的刻蚀1)、在硅片上旋转涂覆SU‑8光阻胶，通过标准光刻方法限定刻蚀区域，仅刻蚀平行的微流体信道需要覆盖的区域；2)、通过NH4F/AgNO3试剂引入Ag纳米颗粒沉积，在硅片表面形成钠米粒子膜；3)、采用H2O2/NH4F进行刻蚀，得到与平行的微流体信道相对应的钠米线；4)、先采用浓硝酸洗去Ag纳米颗粒，然后采用浓硫酸/双氧水混合溶液清洗硅片表面，然后去离子水洗涤干净；浓硫酸/双氧水的体积比为3:1；三、硅纳米线的表面修饰和生物功能化1)、用无水乙醇清洗硅纳米线基底，超净环境下N2气吹干；2)、新鲜制备的质量浓度为1.0％的3‑氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，并将清洗干燥后的具有硅纳米线的硅片浸泡在其中半小时；3)、取出表面键合3‑氨基丙基三乙氧基硅烷的硅片，用工业级乙醇清洗，N2气吹干；4)、将硅片在新鲜制备的50ng/mL的聚乙二醇2‑氨基乙基醚生物素PBS溶液中静置3小时，以工业级乙醇清洗，N2气吹干后保存在4℃干燥环境下备用；5)、在样品测试前，用PBS清洗芯片表面两次后，加入200μL的5.0μM链霉亲和素溶液，37℃孵育1小时；PBS清洗后，再和含有生物素修饰的p‑EpCAM和p‑cKit两种多肽的200μL PBS溶液共孵育1小时，以PBS清洗后用于CTC的捕获；四、硅纳米线基底的修饰和PDMS微流体芯片的组装1)、制备5.0μM的链霉亲和素PBS溶液200μL，覆盖在PDMS微流体芯片上，于37℃静置1小时，PBS清洗三遍；PBS清洗后，再和含有生物素修饰的p‑EpCAM和p‑cKit两种多肽的200μL PBS溶液共孵育1小时，以PBS清洗后用于CTC的捕获；2)、再将硅纳米线基底的芯片放置到芯片载台上，并将平行的微流体信道与钠米线相对应，再以载台的上盖压住微流体芯片；3)、将入口和出口处的PDMS孔洞连接分别连接Tygon流体输送管，并和已经安装在注射泵上的注射器链接。