[发明专利]一种高效率提取霉菌基因组DNA的方法

摘要

本发明提供一种高效率提取霉菌基因组DNA的方法，属于生物工程领域。所述方法将霉菌菌体经过简易的物理研磨方法，采用溶液A进行多次洗涤，可以去除菌体粉末中的大部分疏水性蛋白和培养液中的金属离子。其有益效果体现在1、采用分析纯的石英砂同液氮一起研磨，不仅对霉菌的细胞壁的破坏加大，还可以很轻松的将菌块分散成粉末。2、采用溶液A对研磨后的菌体粉末进行多次洗涤，尽可能将DNA在洗涤液中的溶解量降到最小，使残留的菌体碎片中的DNA含量达到总产量的90%。3、采用常见的试剂，方便霉菌DNA大量提取，易于实现和放大生产。本发明可适用于所有霉菌，得到的基因组DNA的纯度高，满足后续的构建文库、DNA测序等。

主权项

一种简单高效提取霉菌基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）预处理：将霉菌接种在液体培养基（察氏培养基）中，28℃下培养5‑7天，然后将菌体收集，抽滤尽最大可能的去除水分，称重后，取100mg菌体放入研磨器中，按重量比计算石英砂：菌体为0.25‑2：1的比例加入石英砂，随后加入研磨器容量约1/2V的液氮，在液氮挥发时，用研磨棒按压菌体，待液氮挥发干净后，利用其中石英砂将冻实的菌体研磨成粉末，该操作重复3‑6次，总用时大约2min；2）细胞洗涤：将已经研磨成粉末的菌体用勺子盛入2mL EP管中，加入1mL溶液A，颠倒4‑6次后，12000转离心10min，留下沉淀，丢弃上清液；3）细胞裂解：将上一步的沉淀与1mL 溶液B混匀，置于65℃水浴锅中，温育30min后，取出，12000转离心10min，收集上清液于2mL EP管中，标记为S；留下沉淀，与1mL 溶液C混匀，置于65℃水浴锅，温育60min后，取出，12000转离心10min，收集上清液于2mL EP管中，标记为C；4）去除蛋白质：将步骤3）中的标记为S和C的上清液与酚氯仿溶液等体积混匀，12000转离心5min，收集上层水相，分别转移至两个新的1.5mL EP 管中；5）DNA沉淀：将步骤4）收集的水相按相同体积添加异丙醇，摇匀，12000转离心5min，丢弃上清液；6）DNA洗涤：加入700mL 70%乙醇，用枪头轻刮管壁，使管壁上的DNA沉落于管底，12000转离心5min，该步骤重复2次；7）DNA保存步骤6）处理完毕之后，风干，加入60μL含有0.01g/ml的RNA酶的1×TE 缓冲液溶液溶解沉淀的DNA；所述步骤2）中溶液A组成如下：2‑15%SDS，50mM EDTA, 100mM Tris，0‑0.48M NaCl，用固体氢氧化钠调pH至 9‑10；所述步骤3）中溶液B组成如下：10%SDS，50mM EDTA, 100mM Tris；溶液C组成如下：2%CTAB，0.9M NaCl，50mM EDTA, 100mM Tris；所述步骤4）中酚氯仿溶液组成如下： 苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1；所述步骤6）中1×TE 缓冲液组成如下：5mM EDTA, 10mM Tris‑HCl。