[发明专利]一种同步检测SPVG、SPLV和SPMMV的方法

摘要

本发明涉及一种同步检测SPVG、SPLV和SPMMV的方法，属于植物保护领域；通过分别设计合成SPVG、SPLV和SPMMV的正向引物、反向引物和探针，建立同时检测三种病毒的实时荧光多重RT‑PCR方法，检测植物细胞色素氧化酶基因（COX）的引物和探针被作为内参纳入实时荧光多重RT‑PCR的体系构建，避免因模板核酸质量差导致的假阴性结果。本发明对SPVG的检测灵敏度达到10

主权项

1.一种同步检测SPVG、SPLV和SPMMV的方法，其特征在于：具体步骤为： 1）设计合成引物和探针，其中，R = A或G，K=G 或T： a. 分别设计并合成检测SPVG、SPLV和SPMMV的正向引物qSPG-1F、qSPL-2F和qSPM-1F，引物序列如下： qSPG-1F：5’- TTGTTTGGTTTGGACGGAAACGT-3’， qSPL-2F：5’- AAGGAAGCATACTTCCAGATGAA -3’， qSPM-1F：5’-CACTTGAACCAGGTACAGCT -3’； b. 分别设计并合成检测SPVG、SPLV和SPMMV的反向引物qSPG-1R、qSPL-2R和qSPM-1R，引物序列如下： qSPG-1R：5’-AAGAGGTTAKGTATATTCCTTGTAA-3’， qSPL-2R：5’-TATGCCGCTCGGTRTTTTCCT-3’， qSPM-1R：5’-AAATATGAATTAACCAACCACGTGA-3’； c. 分别设计合成检测SPVG、SPLV和SPMMV的探针qSPG-1P、qSPL-2P和qSPM-1P，探针序列如下： qSPG-1P：5’- ACGCARGAAGAAGATACGGAGAGGCA-3’，qSPL-2P：5’- AGCGCTCACAAATACACATCATCGGCTGT -3’， qSPM-1P：5’-AAGTGTTTCGGCATGGTGTGGTTRGACA-3’； d. 分别合成检测植物COX基因的正向引物qCOX-F、反向引物qCOX-R和探针qCOX-P，引物和探针序列如下： qCOX-F：5’-CGTCGCATTCCAGATTATCCA -3’， qCOX-P：5’- TGCTTACGCTGGATGGAATGCCCT -3’， qCOX-R：5’- GGATATATAAGAGCCAAAACTGC -3’； e. 探针标记：利用FAM、Texas Red、HEX和 Cy5分别对SPVG、SPLV、SPMMV和COX的探针进行标记； 2）采用CTAB法提取感病植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板； 3）采用一步法多重实时荧光 RT-PCR扩增。/n