[发明专利]东北红豆杉悬浮细胞的玻璃化超低温保存方法

摘要

本发明涉及一种东北红豆杉悬浮细胞的玻璃化超低温保存方法，该方法包括下述步骤：取第7次继代培养的东北红豆杉细胞，在B5液态培养基中悬浮培养11～13d后进行预培养1.5～2.5d；预培养基由B5液体培养基中加入蔗糖和二甲基亚砜混合制成；将悬浮细胞从预培养基中分离出来，在60％的玻璃化保护剂PVS4中预处理25～35min；将悬浮细胞加入预冷到0℃的100％PVS4中，并在0℃脱水35～45min后将悬浮细胞加入预冷到0℃的新鲜100％PVS4液体，然后转移到冷冻管中，投入液氮冷冻。本发明具有存活率高、所需设备简单、处理步骤方便和重复性好等优点，细胞保存长期安全稳定，成本低。

主权项

一种东北红豆杉悬浮细胞的玻璃化超低温保存方法，其特征在于包括下述步骤：步骤一、预培养：取第7次继代培养的东北红豆杉细胞，在B5液体培养基中悬浮培养11～13d，之后采用预培养基进行预培养，预培养天数为1.5～2.5d；所述预培养基由B5液体培养基中加入蔗糖和二甲基亚砜混合制成，混合液中蔗糖浓度为0.6～0.8mol/L，二甲基亚砜浓度为45～55g/L；步骤二、预处理：离心处理，将悬浮细胞从预培养基中分离出来，室温下在60％的玻璃化保护剂PVS4中预处理25～35min；60％的玻璃化保护剂PVS4由含有蔗糖的B5液体培养基与100％PVS4按40:60的体积比配制而成的混合溶液，其中蔗糖在B5液体培养基中的浓度为0.14～0.15mol/L；步骤三、脱水处理：离心处理，将上清液去除，然后将悬浮细胞加入预冷到0℃的100％PVS4中，并在0℃脱水35～45min。步骤四、冷冻：将步骤三脱水处理后的悬浮细胞经过离心处理，将上清液去除，添加预冷到0℃的新鲜100％PVS4液体，转移到冷冻管中，然后旋紧冷冻管摇匀后迅速将其投入液氮中冷冻。