[发明专利]一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法

摘要

本发明提供了一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法，包括临床呼吸道样本采集和选取；细菌培养与鉴定；核酸提取与纯化；质控/内标质粒构建；测序引物设计与合成；临床分离株高保真体系优化、扩增及结果判断；高保真PCR产物测序与质控；三重qPCR引物、探针设计与合成标记；三重qPCR体系优化、扩增及结果判断，本发明的有益效果在于可同时检测肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA两个持家基因，所用引物和探针根据我国流行分布株基因测序结果有效避开变异区或突变点设计而成；痰液样本加入痰液快速液化杀菌剂，可快速完全液化、能杀死致病微生物，保护操作者不被感染；比既住方法缩短时间近一个小时，具有操作简便、快速、安全、灵敏的特点。

主权项

一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)临床呼吸道样本采集和选取：痰液样本采用吸痰或深咳法，留取于无菌痰培养瓶内，经涂片革兰氏染色镜检，白细胞>25个/HP，鳞状上皮细胞<1O个/HP判为合格，否则弃用；肺泡灌洗液直接注入无菌痰培养瓶内，共收集合格样本若干份；(2)细菌培养与鉴定：将合格的痰液或肺泡灌洗液接种于血平板和麦康凯平板，置于35℃的CO2孵化箱内，培养24‑48小时；挑取灰白色、大而粘稠、有拉丝的可疑菌落，进行革兰氏染色、氧化酶和触酶试验，革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性和触酶阳性，再用细菌生化鉴定仪和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪及配套试剂进行双鉴定，两种鉴定方法均报告为肺炎克雷伯菌的方法作为实验用菌株；(3)核酸提取与纯化：①痰液细菌基因组核酸提取与纯化：在痰液收集瓶中加入1‑2倍体积痰液液化杀菌剂，漩涡振荡5分钟，吸取液化痰液100ul用核酸提取仪及配套试剂，上机提取纯化细菌基因组核酸；②肺泡灌洗液细菌基因组核酸提取：直接取肺泡灌洗液100ul同痰液一样上机提取纯化；③培养细菌基因组核酸提取：挑取纯培养菌落用生理盐水调成0.5MCF菌悬液，吸菌悬液100ul同痰液一样上机提取纯化；④将上述①、②、③提取纯化后的核酸吸入无酶EP管，冻存于‑86℃冰箱备用；(4)质控/内标质粒构建：用DNAMN软件生成一段1000bp随机DNA序列，其中A、T、C、G四种碱基各占25％，插入PBSK载体构建质粒并提取质粒核酸；(5)测序引物设计与合成：从GenBank数据库下载肺炎克雷伯氏菌rcsA和23S rRNA基因序列各50条，用DNAMN比对软件分别进行比对，避开变异区或突变点后，用Primer 5设计rcsA、23S rRNA基因和质控/内标质粒测序引物；(6)临床分离株高保真体系优化、扩增及结果判断：经优化，高保真PCR反应体系为25.0μL，包括2×Buffer 12.5ul、dNTP MIX(10mM each)0.5μL、10μM引物各0.5μL、53倍高保真热启动DNA聚合酶(1U/ul)0.5μL、50×EvaGreen 0.5ul、模板5.0μL，加无菌双蒸水至终体系25.0μL；PCR扩增采用3步法，参数为：95℃2分钟；95℃10秒，59℃10秒，72℃30秒，30个循环，选择FAM通道于延伸阶段探测荧光，以含模板的扩增曲线呈“S”形，CT值≤21，扩增曲线与基线夹角≥30°，且不含模板的扩增曲线与基线平行，判为扩增良好，用该方法高保真扩增94株经步骤(2)所述方法确定为肺炎克雷伯菌的临床分离株rcsA和23SrRNA基因及质控/内标质粒；(7)高保真PCR产物测序与质控：将步骤(6)扩增良好的高保真PCR产物进行测序，以质控/内标质粒测序结果与步骤(4)所述序列100％符合方接受临床分离株测序结果；(8)三重qPCR引物、探针设计与合成标记：根据步骤(7)的测序分析比对结果，避开变异区或突变点后，用Primer 5设计肺炎克雷伯菌rcsA和23S rRNA基因及质控/内标质粒引物和探针；(9)三重qPCR体系优化、扩增及结果判断：经优化后，三重qPCR反应体系为40.0μL，包括10×Buffer 4.0ul、dNTP MIX(10mM each)0.8μL、10μM引物各1.2μL、10μM探针各0.4μL、化学修饰热启动DNA聚合酶(1U/ul)0.5μL、抗体热启动DNA聚合酶(1U/ul)0.5μL、50 Copies/ul质控/内标质粒0.1μL，模板20.0μL，加无菌双蒸水至终体系40.0μL；qPCR扩增采用两步法，参数为：95℃2分钟；95℃10秒，60℃30秒，40个循环，选择FAM、VIC和ROX三通道于退火延伸阶段探测荧光，以三个通道扩增曲线均呈“S”形，CT值均≤36，扩增曲线与基线夹角均≥30°判为阳性，否则判为阴性。