[发明专利]一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法

摘要

本发明公开了一种可以用来维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法，包括小鼠上胚层干细胞在本发明培养条件下的获取、传代和培养，以及对本发明条件下培养的小鼠上胚层干细胞自我更新状态进行观察与检测。本发明方法解决了传统培养条件下细胞状态不稳定、传代操作不方便以及现有培养条件成本高、作用因子复杂和不利于后续探究等问题，具有经济高效、操作便捷、效果稳定、利于研究等优点，而且可以为改善目前人胚胎干细胞以及其他种类多能性干细胞的培养条件提供线索，对于促进干细胞基础与应用研究的顺利开展具有重要作用。

主权项

1.一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）小鼠上胚层干细胞的获取；（2）小鼠上胚层干细胞在IWR1+Y27632条件下的传代和培养；a、取1.4‑1.6 ml、 0.09‑0.11% 浓度的明胶加入34‑36 mm BD Falcon细胞培养皿，置于36‑38℃、4.5‑5.5% CO₂浓度的细胞培养箱内，包被0.8‑1.2 h；b、取生长至70 ‑ 80% 密度的上胚层干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，以除去残留的培养液；c、加入0.8‑1.2 ml 0.09‑0.1% 浓度的胶原酶Ⅳ消化细胞，4.5‑5.5 min左右，细胞边缘浮起，用移液器吹打，转移至14‑16 ml Eppendorf离心管中，加入2.8‑3.2 ml DMEM培养液，继续吹打，使之混匀而终止消化；d、900‑1100 rpm离心2.8‑3.2 min后，吸去上清，加入2.8‑3.2 ml培养液重悬细胞；e、重复步骤d；f、900‑1100 rpm，离心2.8‑3.2 min，吸去上清后，加入适量培养液重悬细胞，在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；g、取步骤a已包被好的培养皿，弃明胶，向培养皿孔内加入1.8‑2.2 ml DMEM培养基，其中含有：9‑11% FBS，0.9‑1.1% MEM非必须氨基酸，1.9‑2.1 mM L‑Glutamin，0.09‑0.1 mM β‑巯基乙醇，0.9‑1.1 mM丙酮酸钠，90‑110单位的青霉素和90‑110 µg的链霉素；h、向培养基中加入1.9×10⁴‑2.1×10⁴个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；i、依次添加3.9‑4.1 µM IWR1和0.9‑1 .1 µM Y27632，水平十字形晃动，使其混合均匀；j、将细胞培养皿置于36‑38℃、4‑6% CO₂浓度的细胞培养箱内培养，即可。