[发明专利]一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法

摘要

本发明公开了一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法，具体步骤为混匀后得到骨髓悬液；得到自体血清；将骨髓悬液加入含细胞分离液的离心管中，进行梯度离心；得到的沉淀即为目的细胞；将目的细胞加入15ml含FGF‑2、自体血清、庆大霉素的DMEM高糖培养基中，置于培养箱中培养，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基；细胞培养3‑4周后，细胞传代3次；用生理盐水重悬细胞；用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜的糙面上；待胶原膜吸附细胞10‑15min后，即可。本发明具有治疗效果好、治疗方便、成本低等优点。

主权项

一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法，其特征在于：具体步骤为：（1）、在无菌条件下，用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去针头后，加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混匀后得到骨髓悬液，备用；（2）、在无菌条件下，取患者外周血100‑200ml，置于血袋中，密封带入实验室中，然后将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再对上清离心30min，去沉淀，0.22 μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，进行梯度离心，即在2000rpm的条件下，离心20min；（4）、 吸取中间白膜层，再加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min， 弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；（5）、向DMEM高糖培养基中加入FGF‑2、自体血清、庆大霉素，直至DMEM高糖培养基中的FGF‑2的质量浓度为10 ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，然后将目的细胞加入15ml含10 ng/ml FGF‑2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的DMEM高糖培养基中，吹打计数，以5×105/cm2接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基同样含10 ng/ml FGF‑2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml；（6）、细胞贴壁达到90%以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶‑ EDTA 溶液，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的CO2温箱2‑3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入3‑5ml高糖DMEM培养基终止消化；（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖DMEM培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；（9）、向DMEM高糖培养基中加入FGF‑2、自体血清、庆大霉素，直至DMEM高糖培养基中的FGF‑2的质量浓度为10 ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，用含10 ng/ml FGF‑2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的高糖DMEM培养基调节细胞浓度为1×108/L，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；（10）、细胞培养3‑4周后，细胞传代3次；（11）、吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶‑ EDTA 溶液，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于温箱2‑3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入3‑5ml高糖DMEM培养基终止消化；（12）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；（13）、用0.3‑1ml生理盐水重悬细胞，得到细胞悬液；（14）、取无菌干燥猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根据膜的面积，细胞数约2×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；（15）、待胶原膜吸附细胞10‑15min后，即可。