[发明专利]一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法

摘要

本发明提供一种有助于恒温扩增体系中生成单链产物的方法；所述单链产物生成方法如下：所述恒温扩增体系包含有两对引物，F1、R1和BF、BR，在某些条件下，F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶区域。本发明反应速率快、成本低、操作简便，能够通过恒温扩增方法生成单链DNA扩增产物，克服背景技术中存在的技术缺陷。

主权项

一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）设计两对引物，F1、R1和BF、BR，其中F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶作用区域；（2）选取反应酶，包括具有链取代活性的聚合酶和切口酶，所述聚合酶能够在引物与模板结合之后在引物的3'端加成核苷酸，使得引物的3'不断延伸，并取代原来模板链的互补链；所述切口酶能够识别特异性的核苷酸序列，并在含有此序列的上游、中间、或者下游的双链DNA的其中一条链上产生缺口；（3）选取核酸阻遏物，该核酸阻遏物能够与所述恒温扩增体系的一条产物进行互补配对，防止引物与所述产物结合后被聚合酶被过度延伸；（4）所述单链产物的生成方法具体包括以下步骤：（ⅰ）在某些反应温度下，引物F1和BF与同一条模板链结合，引物BF在引物F1的上游，（ⅱ）在聚合酶的作用下，引物F1的3’末端被聚合酶延伸，（ⅲ）在相同的反应温度下，引物BF的3'末端被延伸，并取代F1延伸所得的产物S1，（ⅳ）引物R1和BR与产物S1结合，引物BR在引物R1的上游，（ⅴ）在聚合酶的作用下，引物R1的3’末端被聚合酶延伸，（ⅵ）在相同的反应温度下，引物BR的3'末端被延伸，并取代R1延伸所得的产物P1，（ⅶ）在相同的反应条件下，引物F1与产物P1结合，并在聚合酶的作用下延伸引物的3’末端，（ⅷ）切口酶特异性识别双链DNA产物的切口位点，并在双链区的特异性位点的其中一条DNA链上产生一缺口，（ⅸ）在聚合酶的帮助下，具有缺口的DNA链3'末端继续被延伸，并取代原来的切口位点下游的DNA链，当切口酶浓度较低时，生成产物A1，当切口相对过量时，生成产物E1，（ⅹ）引物R1的识别区域与产物A1或产物E1结合，并在引物R1的3'末端沿着产物A1或E1进行延伸，同时，核酸阻遏物与A1或E1结合，（xi）当延伸至核酸阻遏物的位置时，聚合酶的链取代作用不足以取代下强碱基互补配对的核酸阻遏物，引物延伸终止，（xii）切口酶特异性切割出短的延伸产物，生成单链扩增产物。