[发明专利]一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法

摘要

本发明公开了一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，该方法是从大鲵尾部获得皮肤组织，利用组织块法分离获得原代大鲵皮肤表皮细胞，在28℃及特定培养液(成分：DMEM/F12(60％)+15％FBS+5μg/mL胰岛素+10ng/mL KGF)中进行原代和传代培养，并利用RT‑PCR对获得的大鲵皮肤表皮细胞进行特异性基因(K5、K10和P63)表达鉴定。本发明利用相近物种基因序列的同源性设计引物来对大鲵K5、K10和P63基因进行PCR扩增，首次获得大鲵K5、K10和P63基因序列。本发明提供的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养和鉴定的方法，为大鲵皮肤的深层次研究以及利用大鲵皮肤表皮细胞进行皮肤再生、创伤修复以及构建组织工程皮肤奠定了基础。

主权项

1.一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取活体大鲵尾部的皮肤组织，放入PBS缓冲液中；（2）在10min内，将放入PBS缓冲液的皮肤组织表面的粘液刮去，再放入75%酒精中浸泡10s；（3）用PBS缓冲液清洗6‑8次，将皮肤组织剪成直径1mm的组织块，将组织块贴到T25培养瓶中，加入4mL培养液进行贴壁培养，每天更换新鲜培养液，皮肤组织块贴壁培养6天后进行传代培养，得到大鲵皮肤表皮细胞；所述的培养液主要成分为DMEM/F12培养基，除DMEM/F12培养基外，还包括培养液总体积15%的胎牛血清以及在培养液中浓度为5µg/mL的胰岛素、10ng/mL的KGF和双抗，双抗为青霉素和链霉素，其中，青霉素含量为100U/mL、链霉素含量为0.1mg/mL；所述的DMEM/F12培养基是体积分数60%的DMEM/F12培养基。