[发明专利]一种用于单通道双靶点核酸检测的实时荧光PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种用于单通道双靶点核酸检测的实时荧光PCR检测方法，包括：PCR体系中引入了与核酸模板互补的探针和特异性引物，设定PCR扩增程序，进行PCR扩增，扩增循环过程中进行实时的荧光信号采集；扩增循环结束后，扩增程序直接进入熔解曲线分析程序，并收集熔解曲线过程中的荧光信号强度；本发明是基于酶水解探针产生荧光信号及特异性引物扩增后，扩增产物杂交产生荧光信号的两种技术原理，针对单色荧光通道中一个靶点的检测采用探针，另一个靶点的检测采用熔解曲线的方式，进而实现在单色的荧光通道中同时进行两个核酸靶点的检测和分析。 1

主权项

1.一种用于单通道双靶点核酸检测的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括：

PCR体系中引入了与核酸模板互补的探针和特异性引物，设定PCR扩增程序，进行PCR扩增循环，所述PCR扩增循环的过程中，每个循环均在延伸步骤中进行实时的荧光信号强度采集，并通过对实时的荧光信号强度变化对目标靶序列一进行定性分析；所述探针的5’端标记荧光报告基团，所述探针的3’端标记猝灭基团；所述特异性引物标记引物猝灭基团和引物荧光报告基团；所述特异性引物扩增后，产物杂交产生荧光信号；

所述PCR扩增循环结束后，通过采集的荧光信号强度变化绘制熔解曲线对检测的目标靶序列二进行定性分析；

所述通过采集的荧光信号强度变化绘制熔解曲线对检测的目标靶序列二进行定性分析的步骤包括：

采集所述特异性引物的扩增产物的荧光信号强度变化绘制熔解曲线对检测的目标靶序列二进行定性分析；

所述目标靶序列一为甲型流感InfA；

所述目标靶序列二为甲型流感InfB；

所述特异性引物的5’端修饰标记引物猝灭基团，所述特异性引物中间位置标记引物荧光报告基团；

所述引物猝灭基团与所述引物荧光报告基团之间的间距为15‑25nt。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述通过对实时的荧光信号强度变化对检测的目标靶序列一进行定性分析的步骤包括：

通过酶水解所述探针产生荧光强度变化对检测的目标靶序列一进行定性分析。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述探针的Tm值高于所述特异性引物的Tm值5℃‑10℃。

4.根据权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序包括；

预变性和酶激活温度为95℃，时间为1min；

逆转录温度为60℃，时间为30min；

cDNA预变性温度为95℃，时间为1min；

变性温度为95℃，时间为15s；

退火温度为60℃，时间为30s；

延伸及荧光采集的温度为72℃，时间为30s；

熔解曲线分析的温度为55℃‑95℃。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述目标靶序列二特异性引物的核酸序列为：SEQ ID NO:4[BHQ1]‑TTCAAATATCAGACAAAAACAAAACCAA[T(FAM)]CC和SEQ ID NO:5TGTCTATTTTGTTGCTTTAATAATCGAG。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述探针的核酸序列为：SEQ ID NO:3CTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC。