[发明专利]一种食品中志贺氏菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种食品中志贺氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以志贺氏菌ipaC基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤（1）预处理；（2）构建恒温扩增反应体系；（3）荧光定量反应；（4）检测分析。本发明的检测方法灵敏度高，特异性和敏感性强，对模板DNA要求较低，耗时短，方法简便。

主权项

一种食品中志贺氏菌的检测方法，其特征在于，采用恒温扩增方法，以志贺氏菌ipaC基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到TSB胰蛋白胨大豆肉汤中，培养温度为30‑40℃，培养时间为20‑28h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总DNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板 1μL，SYBER Green I荧光染料 0.1μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 10U，甜菜碱溶液 0.5μL，硫酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，IPTG 2μL，谷氨酸溶液 2μL，其余用dd H2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7‑1.9；所述SYBER Green I荧光染料为120‑150倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris‑HCl（pH 8.3）、蔗糖；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述甜菜碱溶液的浓度为2‑6mmol/L；所述硫酸钠溶液的浓度为10‑20mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7‑1.9；所述谷氨酸溶液的浓度为70‑90mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，92‑96℃变性4‑6min，92‑96℃变性0.5‑1.5min；50‑70℃退火20‑40s；68‑76℃延伸0.5‑1.5min；32个循环，最后68‑74℃延伸10min；（4）检测分析：根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。