[发明专利]一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法

摘要

本发明提供一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法；具体包括样品松质骨总蛋白的提取、蛋白浓度的测定、双向凝胶电泳分析、凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析、差异蛋白的MALDI‑TOF‑MS质谱分析以及蛋白质数据库检索及鉴定、确定差异蛋白、通过Western‑Blot、RT‑PCR对部分差异蛋白质进行鉴定并与血清中的差异蛋白ELISA检测结果互相验证，表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白可以用作肾阳虚证动物模型鉴定的生物标志物。本发明有助于为动物实验中肾阳虚证型提供鉴别指标，为进一步发现肾阳虚生物标志物提供了基础。

主权项

1.一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法，其特征在于，所需具体步骤如下：（1）肾阳虚证大鼠模型的建立；（2）差异蛋白的筛选；（3）对部分与肾阳虚证相关差异蛋白的验证；（4）肾阳虚证动物模型生物标志物的确定；所用于构建动物模型的大鼠为WISTAR大鼠；所述差异蛋白筛选的具体步骤如下：大鼠松质骨总蛋白的提取；测定蛋白浓度；双向凝胶电泳分析；凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析；差异蛋白的MALDI‑TOF‑MS质谱分析；蛋白质数据库检索及鉴定，确定差异蛋白；所述部分与肾阳虚证相关差异蛋白的验证方法如下：应用Western‑Blot方法从蛋白质水平对标志物进行验证；应用RT‑PCR方法从基因水平对标志物进行验证；RT‑PCR中采用的基因引物为：Col1a1‑F：ATCCTGCCGATGTCGCTATCCA，Col1a1‑R：AGCCATCCACAAGCGTGCTGTA；Arhgdia‑F：CATTGTGACCCGCTTGACCT，Arhgdia‑R：TCTGTGAAGCGGGACTTGATGT；GAPDH‑F：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，GAPDH‑R：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC；所述肾阳虚证动物模型生物标志物的确定方法为：将血清蛋白的ELISA检测结果与Western‑Blot、RT‑PCR检测结果对比分析，选取表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白作为生物标志物；最终确定的用作肾阳虚证的血清生物标志物为Ⅰ型胶原α‑1链及GDP解离抑制因子1，且与正常组比较，肾阳虚证大鼠Ⅰ型胶原α‑1链及GDP解离抑制因子1表达下降。