[发明专利]一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法

说明书

本发明提供一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法；具体包括样品松质骨总蛋白的提取、蛋白浓度的测定、双向凝胶电泳分析、凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析、差异蛋白的MALDI‑TOF‑MS质谱分析以及蛋白质数据库检索及鉴定、确定差异蛋白、通过Western‑Blot、RT‑PCR对部分差异蛋白质进行鉴定并与血清中的差异蛋白ELISA检测结果互相验证，表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白可以用作肾阳虚证动物模型鉴定的生物标志物。本发明有助于为动物实验中肾阳虚证型提供鉴别指标，为进一步发现肾阳虚生物标志物提供了基础。

技术领域

本发明属于基础研究领域，具体涉及一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法。

背景技术

“证”是中医学理论体系的核心，中医临床首重辨证论治，但辨证很大程度上受医家自身（如对中医药知识的理解、临床经验等）及患者主观因素的影响，难以客观化和定量化，造成辨证结果不统一，影响治法的确立、选方用药及临床疗效的评价，阻碍中医学的研究及发展。中医基础研究中采用动物模型可以模拟疾病的真实过程，与“证”的生理和病理状态相似，因此借助肾阳虚证动物模型是研究肾虚证实质的必由之路。

本实验采用氢化可的松肌肉注射所模拟出的肾阳虚证模型大鼠的症状、体征和血清cAMP、cGMP含量检测及cAMP/cGMP比值结果符合目前常用的肾阳虚证模型的鉴定要求，表明本研究的肾阳虚模型制作是成功的，但以上评价方法以主观评价为主，评价指标缺乏特异性、客观性，研究结果能否科学阐明中医“证”的实质以及所复制的动物证候模型是否具有代表性，同样涉及辨证的客观化和定量化的问题。因此寻找具有一定特异性的客观指标来判别鉴定肾阳虚模型是否成功，是进行后续相关实验的关键。

基于中医“肾主骨”的理论，骨组织作为“肾”功能的外在表现部位之一，其内在生物学特征的变化与“肾”的功能状态必然存在着密切联系。蛋白质是体现组织细胞功能与执行生命活动最直接的活性物质，骨组织的结构与功能状态最终体现于其内在功能蛋白质组和基因组的表达状态。随着对疾病中医“证”与蛋白质组相关研究的深入，目前已经认识到：中医“证”的表现实质是疾病个体特定的功能蛋白质组及其基因组的表达水平；疾病不同中医证型之间区别的实质是功能蛋白质组及其基因组表达水平的差异。因此，通过对骨组织差异蛋白质组表达水平的检测，有望从骨组织功能蛋白质组层面上进一步揭示中医肾阳虚证候的实质。

基于以上理论基础与研究背景，本研究借助于蛋白质组学研究思路和技术上的优势，以大鼠的骨组织（松质骨）为研究对象，分别展示它们在肾阳虚与正常状态下松质骨的蛋白质组图谱，比较它们之间存在的差异表达蛋白质，从松质骨功能蛋白质组层面深入探讨中医肾阳虚证的实质，进一步深化对中医“肾”与骨内在关联的认识。同时，这些差异表达的蛋白质可能在肾阳虚证发生发展过程中发挥重要作用，可能是肾阳虚证诊断的潜在生物标志物。由于生物标记物的发现是冗长而又繁杂的过程，需借助多种实验技术，从多层面多角度反复鉴定、验证及确认。故对于初步筛选的差异蛋白，我们需要从蛋白水平、基因水平进一步对靶定蛋白进行验证，以规避单一实验方法的局限，保证前期蛋白质组学检验结果的准确性。如何选取感兴趣的候选蛋白，对其进一步研究，探讨其与肾阳虚证的密切联系，并同时证明本生物标志物筛选方法的可行性是本研究的重点。

当今科技正步入云媒体、大数据的时代，各种信息蜂拥而至，经云计算、大数据挖掘，一些功能强大、内容丰富、更新频繁的在线蛋白质相互作用数据库(PPI Database)应运而生，已成为研究预测蛋白质功能重要手段之一。本部分研究利用免费在线PPI Database–String10对前期所鉴定出已知蛋白进行系统综合分析，筛选候选蛋白作进一步研究。该数据库覆盖面广、整合度高、更新频率快，并能对蛋白质之间直接和间接相互作用的关系能做出一定的预测，从而可初步在生物信息学层面对所鉴定的差异蛋白在疾病中的作用进行预测，为对后续的验证性研究提供思路。借助于String数据库检索提供的生物学信息提示，同时我们查阅相关文献结合前期研究结果，我们推测肾阳虚证症状和体征的改变可能与某几个关键差异蛋白所在蛋白调控网络的调控密切相关。因此我们挑选了Ⅰ型胶原α-1链和GDP解离抑制因子1作为验证对象。