[发明专利]利用CRISPR/Cas9对线粒体基因组进行靶向编辑的方法

摘要

本发明提供一种利用CRISPR/Cas9技术对线粒体基因组进行靶向编辑的方法，包括如下步骤：构建靶向线粒体基因组的MitoCRISPR载体；将线粒体特异的sgRNA插入到MitoCRISPR载体中，构建线粒体基因敲除或修饰载体；将线粒体基因敲除或修饰载体导入人或动物细胞，从而达到实现编辑人或动物细胞线粒体基因组的目的。本发明用所述的方法对Cas9蛋白和sgRNA元件进行改造,使之进入线粒体并对其基因组相应的基因打靶，进行基因敲除、修饰，以期望清除线粒体内的突变DNA，从而有望治疗多种线粒体病。

主权项

1.利用CRISPR/Cas9技术对线粒体基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n（1）构建MitoCRISPR载体，含可置换的基因调控元件；/n（2）将特异基因的sgRNA插入到MitoCRISPR载体上构建线粒体基因编辑载体；/n（3）将上述线粒体基因修饰载体导入到人或动物细胞，进行线粒体基因组编辑，达到敲除或修饰目标基因的目的；/n所述构建MitoCRISPR载体的方法为，在骨架质粒载体PX459上做如下改造；骨架质粒载体包含CRISPR系统的基本元件，即Cas9基因和U6启动子；在U6启动子后添加促进外源RNA进入线粒体的信号序列，即3’UTR序列；3’UTR序列帮助稳定RNA，使之能从细胞核中出来，定位在线粒体外膜上；然后，加入RP序列，以帮助RNA进入线粒体；接着，去掉Cas9基因前的核定位信号，添加促进外源蛋白进入线粒体的信号序列，即MLS序列；最终得到用于进行线粒体基因组特异基因编辑的MitoCRISPR质粒载体；/n步骤（2）具体方法为：选取步骤（1）中MitoCRISPR质粒载体为骨架，在限制性内切酶BbsI位点上插入目标基因或位点的sgRNA序列，构建线粒体基因敲除或编辑载体；/n步骤（３）具体方法为：将步骤（２）获得的质粒载体导入人或动物细胞，3天后提取细胞全基因组，利用实时荧光定量PCR检测线粒体基因组拷贝数变化，以评估MitoCRISPR系统针对线粒体基因组的敲除效率；或者经DNA测序确定基因编辑的效果；/n实时荧光定量PCR引物如下：H-12sr RNA-qpcr-F: 5’-CTCACCACCTCTTGCTCAG-3’，H-12sr RNA-qpcr-R: 5’-GGCTACACCTTGACCTAACG-3’；β-actin用作内参对照；/n所述的RP序列在3’UTR序列后面，所述方法不包括疾病治疗诊断方法。/n