[发明专利]一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法

摘要

本发明涉及一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，具体包括如下步骤：（1）、制备预处理磁珠，（2）、制备磁珠受体偶联物，（3）、灵芝提取物的预处理，（4）、制备磁珠受体灵芝多糖偶联物，（5）、磁珠受体多糖偶联物的裂解，（6）、抗雾霾护肺灵芝多糖的纯化；所述抗雾霾护肺灵芝多糖中的灵芝多糖含量为95%以上。本发明的抗雾霾护肺灵芝多糖弥补了现有防治雾霾性肺系疾病的产品效果不理想、使用不方便等问题；抗雾霾护肺灵芝多糖是直接靶向肺部炎性受体的多糖，多糖靶点明确；本发明的制备方法通过磁场分离、受体识别及膜分离，避免了有机溶剂残留等问题，将促进灵芝提取物在保健品、药品等领域的应用。

主权项

1.一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，其特征在于操作步骤如下：（1）用乙二胺四乙酸溶液和磷酸缓冲液悬浮处理磁珠，得到预处理磁珠；（2）用受体蛋白溶液处理预处理磁珠，制得磁珠受体偶联物；（3）用灵芝提取物溶液处理预处理磁珠，制得多糖供体液；（4）将磁珠受体偶联物与多糖供体液在孵育液中进行孵育，得到磁珠受体多糖偶联物；（5）将磁珠受体多糖偶联物用裂解液处理，得到磁珠受体偶联物和灵芝多糖初液；磁珠受体偶联物回步骤（4）重复利用；（6）将灵芝多糖初液上柱洗脱、超滤膜浓缩、冷冻干燥或喷雾干燥，得到抗雾霾护肺灵芝多糖；所述抗雾霾护肺灵芝多糖中的灵芝多糖含量为95%以上；具体操作步骤如下：（1）、制备预处理磁珠先将磁珠置于反应釜中，加入浓度292~585g/l的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液形成第一磁珠悬液，且第一磁珠悬液的浓度为30~40 mg/ml，悬浮1~2 h；接着将反应釜置于磁力釜中分离3~5 min，取出反应釜，弃去上清液；再向反应釜中加入磷酸缓冲液形成第二磁珠悬液，使第二磁珠悬液的浓度为30~40 mg/ml，悬浮1~2 h，接着将反应釜置于磁力釜中分离3~5min，取出反应釜，弃去上清液；重复上述操作2~3次，得到预处理磁珠；所述磷酸缓冲液由7.9g 氯化钠（NaCl）、0.2g氯化钾（KCl）、0.24g 磷酸二氢钾（KH2PO4）和1.8g 磷酸氢二钾（K2HPO4）溶于800 ml 蒸馏水中，用盐酸（HCl）调节pH值至7.4，再加蒸馏水定容至1 L制得；（2）、制备磁珠受体偶联物先将预处理磁珠置于反应釜中，加入偶联液，使预处理磁珠的含量为30~40 mg/ml；接着加入受体蛋白溶液，加入量按体积比受体蛋白溶液︰偶联液=1︰25~1︰30，在温度20~25℃、搅拌转速100~150 r/min条件下偶联60~72h；再将反应釜置于磁力釜中分离5~10 min，取出反应釜，弃去上清液，通过检测上清液中280nm处吸光值监控偶联率，得到磁珠受体偶联物；所述偶联液由7.9g 氯化钠（NaCl）、0.2g氯化钾（KCl）、0.24g 磷酸二氢钾（KH2PO4）和1.8g 磷酸氢二钾（K2HPO4）溶于800 ml 蒸馏水中，用盐酸（HCl）调节pH值至7.0，再加蒸馏水定容至1 L制得；所述受体蛋白溶液为用偶联液配制成的质量浓度2~5 mg/ml 的受体蛋白溶液；（3）、灵芝提取物的预处理先将预处理磁珠置于反应釜中，加入偶联液，调整预处理磁珠浓度为30~40 mg/ml；接着加入灵芝提取物溶液，加入量按体积比灵芝提取物︰偶联液=1︰15~1︰20，在温度20~25 ℃、搅拌转速100~150 r/min条件下偶联60~72h，以去除灵芝提取物中能与预处理磁珠偶联的多糖；再将反应釜置于磁力釜中分离5~10 min，取出反应釜，收集上清液，即得到多糖供体液；所述偶联液与步骤（2）中所述偶联液相同；所述灵芝提取物溶液为用灵芝提取物和偶联液配制成的质量浓度为5~10 mg/ml 的灵芝提取物溶液；（4）、制备磁珠受体多糖偶联物先将磁珠受体偶联物置于反应釜中，加入孵育液，调整磁珠受体偶联物浓度为40~50 mg/ml；接着加入多糖供体液，加入量按体积比受体蛋白溶液︰多糖供体液=1︰5~1︰10，在温度30~35 ℃、搅拌转速50~100 r/min条件下孵育18~24h；再将反应釜置于磁力釜中分离5~10 min，取出反应釜，弃去上清液，通过蒽酮比色法检测上清液中糖含量监控孵育率，得到磁珠受体多糖偶联物；所述孵育液是将7.9g氯化钠（NaCl）、0.2g氯化钾（KCl）、0.24g磷酸二氢钾（KH2PO4）和1.8g磷酸氢二钾（K2HPO4）溶于800 ml 蒸馏水中，用盐酸（HCl）调节pH值至6.5~7.0，再加蒸馏水定容至1 L制得；（5）、磁珠受体多糖偶联物的裂解将磁珠受体多糖偶联物置于反应釜中，加入裂解液，调整磁珠受体多糖偶联物浓度为20~30 mg/ml，在温度20~25 ℃、搅拌转速100~150 r/min条件下裂解36~48h；再将反应釜置于磁力釜中分离5~10 min，得到磁珠受体偶联物和上清液；磁珠受体偶联物回步骤（4）重复利用；取上清液即得到灵芝多糖初液；所述裂解液由1.0g Tween‑20、27.22g三水醋酸钠和11.5ml 醋酸，溶于800 ml 蒸馏水中，用醋酸调节溶液的pH值至4.4~5.0，最后加蒸馏水定容至1 L制得；（6）、抗雾霾护肺灵芝多糖的纯化取灵芝多糖初液，上Bio‑Gel柱，用1~2 ml/min去离子水洗脱，通过蒽酮比色法检测洗脱液中糖含量监控洗脱效果，收集洗脱液；最后将洗脱液用截留分子量为1000~2000 Da的超滤膜浓缩，超滤浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥后，即得到抗雾霾护肺灵芝多糖。