[发明专利]一种乌拉立肽的制备方法

摘要

本发明涉及多肽合成技术领域，公开了一种乌拉立肽的制备方法，包括以下步骤：1)合成全保护线性肽树脂；2)裂解得到线性肽；3)氧化得到乌拉立肽；4)纯化，转盐，冻干得乌拉立肽精品。本发明方法工艺简单，能够降低乌拉立肽的合成难度，合成得到的乌拉立肽收率高，成本较低，纯度在98％以上，利于推广。

主权项

1.一种乌拉立肽的制备方法，其特征在于：所述乌拉立肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY；所述制备方法包括以下步骤：1)合成全保护线性肽树脂：以Fmoc‑Tyr(tbu)‑Wang Resin树脂作为固相载体，将所述Fmoc‑Tyr(tbu)‑Wang Resin树脂与DCM或DMF混合，鼓动或震荡或搅拌25‑35min，使树脂充分溶胀，然后抽掉溶液，用DMF将Fmoc‑Tyr(tbu)‑Wang Resin树脂洗净；向Fmoc‑Tyr(tbu)‑Wang Resin树脂中加入其2‑3倍体积量的脱保护试剂反应4‑6min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂2‑3倍体积量的脱保护试剂反应8‑12min，获得H‑Tyr(tbu)‑Wang Resin；用DMF洗净，抽掉溶液；取Fmoc‑Arg(pdf)‑OH与H‑Tyr‑(tbu)‑Wang Resin通过偶联剂进行偶联，用茚三酮检测法确定反应进程，偶联不完全可延时或重复投料，偶联完全获得Fmoc‑Arg(pdf)‑Tyr(tbu)‑Wang Resin；抽掉，用DMF洗净；重复上述步骤依次偶联剩余氨基酸直至N端最后一个氨基酸苏氨酸，其中13位和14位的两个Gly采用Fmoc‑Gly‑Gly‑OH一步偶联；加入脱保护试剂脱出N端苏氨酸Fmoc保护基团；用DMF、DCM、无水甲醇分别洗三遍收缩树脂，得到全保护线性肽树脂；无水甲醇每次洗涤的时间为2‑10min；其中，所述Fmoc‑Tyr(tbu)‑Wang Resin树脂为市购或以Wang Resin树脂作为固相载体，在Wang Resin树脂上偶联Fmoc‑Tyr(tbu)‑OH得到Fmoc‑Tyr(tbu)‑Wang Resin树脂；所述脱保护试剂为体积百分比为20％的DBLK溶液；所述偶联剂为DIPEA、NMM、DIC、HATU、TBTU、PYBOP、HOBT中的一种或多种组合；2)裂解得到线性肽：配制裂解液将进行冷冻，所述裂解液由以下体积百分比的组分配得：TFA85％，茴香硫醚5％，EDT含量5％，苯酚3％，水2％；将冰裂解液和步骤1)所得的全保护线性肽树脂在‑10℃至10℃下混合震荡10‑20min，升温至23‑27℃，震荡2‑4小时；抽滤，收集滤液，将滤液加入到冰乙醚中析出，沉淀，通过抽滤或离心收集沉淀物；用乙醚将所述沉淀物洗涤3‑6遍，真空干燥后，得到乌拉立肽线性肽固体，测质谱MS并通过HPLC检测；3)氧化得到乌拉立肽：对步骤2)所得的乌拉立肽线性肽进行氧化，使多肽中两个半胱氨酸的侧链巯基搭桥成环得到乌拉立肽，具体为：将乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到6‑9，敞口室温下搅拌24‑48h，进行自然氧化或加入辅助氧化剂氧化；用HPLC检测反应进程，直至乌拉立肽线性肽完全环化；所述辅助氧化剂氧化为双氧水氧化或DMSO氧化或碘氧化；所述DMSO氧化具体为向未成环的乌拉立肽线性肽中加入质量浓度为1～10％的DMSO，辅助氧化30min‑24h；所述双氧水氧化为向未成环的乌拉立肽线性肽中加入质量浓度为30％的双氧水溶液，双氧水溶液添加量为乌拉立肽线性肽溶液的0.05‑0.15％；采用自然氧化或双氧水氧化或DMSO氧化时，将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到7‑9；采用碘氧化时，将未成环的乌拉立肽线性肽溶解到水中，将pH值调节到6‑7；4)纯化，转盐，冻干得乌拉立肽精品：将步骤3所得的乌拉立肽溶液用0.45μm微孔过滤板过滤；接着通过反向高效液相色谱法分离杂质，提纯收集目标峰溶液；将所述目标峰溶液转盐形成醋酸盐形式或脱盐形成无盐多肽溶液；然后经过浓缩、冷冻干燥后，得到乌拉立肽固体粉末；产物经MS质谱和HPLC确认。