[发明专利]一种促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及应用

摘要

本发明涉及一种促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，该方法为在人羊膜间充质干细胞中添加诱导组合物，所述诱导组合物包括0.01～2g/L透明质酸和0～100mg/L抗坏血酸。本发明与常规诱导方法相比，可显著提高人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化，糖胺聚糖和II型胶原蛋白表达呈强阳性，Col2α1、ACAN和Sox9等软骨形成相关基因和蛋白的表达亦明显上调，能明显提高人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的效率。本发明中诱导组合物可用于人间充质干细胞向软骨细胞分化中以及在软骨损伤疾病中。

主权项

一种促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于：该促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的具体步骤为：（1）人羊膜间充质干细胞的分离培养：将健康足月剖宫产新鲜胎盘钝性机械剥离羊膜，用含1%双抗的D‑Hank’s液反复冲洗羊膜，除去残留血渍和表面粘液后；将羊膜剪成1～3 cm2大小，分装于50mL离心管内，加入约羊膜组织2倍体积的含0.02% EDTA‑2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，于35～37℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化约30 min，经300目不锈钢滤网过滤后，弃去含有羊膜上皮细胞的消化液，重新加入新鲜的含0.02% EDTA‑2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，重复消化一次，再次经300目不锈钢滤网过滤后，弃去消化液；经上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜组织用含1% 双抗的D‑Hank’s液清洗一次，除去残留的胰蛋白酶消化液，加入含0.05 mg/mL DNase I的 0.5 mg/mL II型胶原酶消化液，于35～37℃恒温水浴箱中，150～185 rpm旋转消化1～2 h，直至剩余的羊膜组织碎片完全消化成絮状，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液，1500rpm，4℃离心10 min，弃上清，细胞沉淀即为人羊膜间充质干细胞；用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在35～37℃，含1～10%CO2及85～100%空气饱和湿度恒温培养，待细胞融合度达80%以上进行传代培养；（2）诱导人羊膜间充质干细胞向成软骨细胞分化诱导组合物的制备：在1L高糖DMEM完全培养基中，加入含0.01～2 g/L透明质酸和0～100mg/L抗坏血酸的诱导组合物，即得人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导组合物；（3）诱导组合物促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法：取2代对数生长期人羊膜间充质干细胞，按2×105 cells/孔的细胞量，接种于6孔板内，0～48时间后添加诱导组合物，每2～3天换一次应用基质和诱导组合物，35～37℃，含1～10% CO2及85～100%空气饱和湿度恒温培养箱内培养14～28天，诱导分化终止。