[发明专利]一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA的提取方法有效
| 申请号： | 201610886194.9 | 申请日： | 2016-10-11 |
| 公开（公告）号： | CN106244585B | 公开（公告）日： | 2019-11-22 |
| 发明（设计）人： | 孙恩涛;王康;许树俊;王忆楠 | 申请（专利权）人： | 皖南医学院 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 11308 北京元本知识产权代理事务所 | 代理人： | 范奇<国际申请>=<国际公布>=<进入国 |
| 地址： | 241002 安徽*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：a)研磨工序、b)裂解工序、c)沉淀工序、d)纯化工序。本发明与现有技术相比，通过高温裂解、蛋白酶K变温消化、醋酸钾沉淀、纯化步骤，提高了产率。本发明主要采用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR检测等对提取的线粒体基因组DNA进行质量检测。结果表明，本发明所提取的线粒体基因组DNA的纯度和浓度已满足于群体遗传结构、系统演化、地理分布和构建基因文库等研究的要求。该方法的建立使提取钉螺等小型贝类线粒体基因组DNA过程更加简便、高效。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 简易 高效 钉螺 线粒体 基因组 dna 提取 方法 | ||
【主权项】：
1.一种钉螺线粒体基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：a)研磨工序、b)裂解工序、c)沉淀工序、d)纯化工序；/n所述的a)研磨工序：/n将单只钉螺去除螺壳和消化系统组织，取腹足肌肉组织2-3mg，放入研磨器中，加入50-100μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织1-2分钟，得到含有肌肉组织的匀浆液，将含有肌肉组织的匀浆液转移至离心管中，再加入50-100μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织，重复2-3次，研磨至腹足肌肉成5～30μm的颗粒，最后用100μl的匀浆液冲洗研磨器，形成冲洗液，将数次研磨得到的含有肌肉组织的匀浆液与冲洗液合并，形成研磨好的匀浆液；/n所述的b)裂解工序：/n将300-400μl研磨好的匀浆液放入400-800W微波炉中，功率选择高火，加热6-10分钟后，冷却至室温，形成加热匀浆液；向加热匀浆液中加入15-20μl的SDS,使SDS的终浓度1％,和10-15μl的蛋白酶K,使蛋白酶K的终浓度300～400μg/ml,混合均匀，升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h；再次升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h，形成裂解的匀浆液；/n所述的c)沉淀工序：/n将300-400μl裂解的匀浆液中加入300μl的PH5.4的醋酸钾，上下颠倒8～10次，4℃下静置30-60min，于4℃，14000r/min，离心10-20min，得到第1上清液；/n取500-600μl的第1上清液于离心管中，再加入等体积醋酸钾溶液，上下颠倒7～8次，4℃下静置30-60min，于4℃，12000r/min，离心10-20min，得到第2上清液；/n所述的d)纯化工序：/n取900-1000ul的第2上清液于离心管；加入等体积的异丙醇，-20℃冷藏30-60min后，于4℃，14000r/min，离心15min，去上清；加入200-300μl75％体积浓度的乙醇进行洗涤，重复洗涤2次，将乙醇风干后，用40-60μl双蒸水溶解，-20℃保存备用；/n所述的匀浆液的pH为8.0，由以下物质组成：25mmol/L Tris-HCl，30mmol/L EDTANa2和50mmol/L葡萄糖。/n
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