[发明专利]用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法

摘要

用于治疗肿瘤的PD‑1封闭CIK的制备方法,属于医疗领域，抗人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶；激活步骤，利用所述CD3单克隆抗体、IFNγ以及IL‑2激活培养淋巴细胞；清洗步骤，清洗三次激活培养后的所述淋巴细胞；封闭步骤，用生理盐水悬浮所述清洗后的淋巴细胞，得到悬浮细胞溶液，向所述悬浮细胞溶液中加入PD‑1单克隆抗体，混悬孵育；向所述PD‑1单克隆抗体孵育后的细胞悬液补加生理盐水制得回输细胞悬液。本发明方法制备PD‑1封闭的CIK具有PD‑1单克隆抗体的用量少、封闭PD‑1分子的效果好、肿瘤杀伤活性高等特点。同时具备操作简单、制备成本低和便于临床应用的特点。

主权项

1.用于治疗肿瘤的PD‑1封闭CIK的制备方法，其特征在于包含如下步骤：包被步骤，抗人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶；激活步骤，利用所述CD3单克隆抗体、IFNγ以及IL‑2激活培养淋巴细胞；清洗步骤，清洗三次激活培养后的所述淋巴细胞；封闭步骤，用20‑50ml生理盐水悬浮所述清洗后的淋巴细胞，得到悬浮细胞溶液，向所述悬浮细胞溶液中加入PD‑1单克隆抗体，18‑25℃混悬孵育30分钟得到细胞悬液；包含步骤：过滤步骤，向所述细胞悬液中加入细胞分散剂200目滤网过滤后补加生理盐水至300ml得到回输液；所述抗人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶包含如下步骤：采用0.01M PH9.6的PBS溶液稀释甲级纯化抗人CD3单克隆抗体到浓度50‑70ng/ml；将稀释后的所述甲级纯化抗人CD3单克隆抗体加入到培养瓶中，4℃放置24小时以上；所述激活步骤包含如下步骤：将肝素抗凝血注入离心管A中, 4℃温度下以3000rpm离心5min；取上层血浆移入离心管B，56℃水浴30min, 在4℃温度下以3000rpm离心15min ，收集上清，4℃保存备用；下层血细胞留于离心管A中备用；生理盐水悬浮所述离心管A中的所述血细胞，将制得的血细胞悬液缓慢加入到装有4 ml 的密度为1.077±0.001 的Ficoll‑Hypaque的离心管中，在4℃温度下以3000rpm离心20min；收集单个核细胞层细胞并采用离心法清洗所述细胞三次；加入无血清培基重悬，制得无血清培基悬浮细胞；将所述的无血清培基悬浮细胞加入到含有所述抗人CD3单克隆抗体包被的培养瓶中，加入灭活血浆并补加入无血清培基，37℃、5%CO₂条件下培养24小时；向培养瓶中加入IFNγ，37℃、5%CO₂条件下培养4‑6天；取培养后的细胞移入细胞培养袋中，加入无血清培基、灭活血浆和IL‑2，37℃、5%CO₂条件下培养4‑5天；补加无血清培基和IL‑2， 37℃、5%CO₂条件下培养4‑5天；取培养液20ml进行细菌培养并利用PCR技术检测支原体；其他细胞即培养袋中的细胞继续培养2天,收集细胞，在4℃下以3000rpm离心5min，弃上清,生理盐水加至50ml, 在4℃下以3000rpm离心5min，弃上清,重复3次；加20‑40ml生理盐水,混匀，加入200μg抗人PD‑1单克隆抗体：终浓度为50‑250μg/ml，混匀；室温18℃‑25℃孵育30min；加浓度为200mg/ml的人血清白蛋白4‑10ml，加生理盐水至50ml,200目滤网过滤，将细胞悬液移入输液袋中，加生理盐水至300ml，热合封口，粘贴标签，用于静脉回输，细胞总数：1×10⁸‑1×10⁹。