[发明专利]基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用有效
| 申请号： | 201610703246.4 | 申请日： | 2016-08-22 |
| 公开（公告）号： | CN106191116B | 公开（公告）日： | 2019-10-08 |
| 发明（设计）人： | 张智英;吴芸;徐坤;白义春;吕慧娇 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10 |
| 代理公司： | 成都坤伦厚朴专利代理事务所(普通合伙) 51247 | 代理人： | 刘坤 |
| 地址： | 712100 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | 本发明提供基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用，系统包括同时具有报告/供体功能的载体及Cas9表达载体，所述报告/供体载体包括两条目标基因同源臂以及位于两条目标基因同源臂之间的外源序列片段；两条目标基因同源臂在目标基因上的同源序分别列位于目标基因靶序列的两侧并与目标基因靶序列相接；外源序列片段包括依次排列的启动子、抗性基因、剪切肽序列、报告基因以及polyA尾，抗性基因内部插入有两段该抗性基因的SSA修复同源序列，并且在两段SSA修复同源序列之间插入有目标基因靶序列。本发明构建了一套能够高效定点精确靶向整合外源基因到內源基因序列的敲入系统，而且能够进行较高效率的双染色体等位基因的双敲入。 | ||
| 搜索关键词： | 基于 crispr cas9 基因 整合 系统 及其 建立 方法 应用 | ||
【主权项】：
1.基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统，其特征在于：该敲入整合系统包括第一报告/供体载体，所述报告/供体载体包括两条目标基因同源臂以及位于两条目标基因同源臂之间的外源序列片段；两条目标基因同源臂在目标基因上的同源序列分别位于目标基因靶序列的两侧并与目标基因靶序列相接；外源序列片段包括依次排列的启动子、抗性基因、剪切肽序列、报告基因以及polyA尾，抗性基因内部具有两段该抗性基因的SSA修复同源序列，并且在两段SSA修复同源序列之间插入有目标基因靶序列；所述敲入整合系统还包括与所述第一报告/供体载体共转染宿主细胞的第二报告/供体载体；所述第二报告/供体载体中的抗性基因与第一报告/供体载体中的抗性基因对应不同的抗性筛选条件；所述第二报告/供体载体中的报告基因与第一报告/供体载体中的报告基因对应不同的检测信号。
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