[发明专利]一种循环双水相体系分离纯化菠萝蛋白酶的方法

摘要

本发明涉及一种循环双水相体系分离纯化菠萝蛋白酶的方法，属于天然产物有效成分的分离纯化技术领域；首先通过预处理得到粗提取的菠萝汁；然后双水相体系一次萃取菠萝蛋白酶，并测定上相菠萝蛋白酶的活性和蛋白质含量，判断萃取效果；然后将聚合物相取出，加入适量的蒸馏水进行稀释，调节溶液的pH值，浊点法二次萃取菠萝蛋白酶并回收聚合物；将分离后的聚合物用于下一次的双水相体系中进行循环萃取实验；该方法工艺流程简单、成本低、操作条件温和，能够保护目标酶的原有结构和活性，并且聚合物可回收再利用，环境污染小。

主权项

1.一种循环双水相体系分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，所述循环双水相体系为聚合物-盐循环双水相萃取体系，/n该方法按照如下步骤进行：/n（1）样品预处理：得到粗提取的菠萝汁，用福林法测定其中菠萝蛋白酶活性，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量；/n（2）双水相体系一次萃取菠萝蛋白酶：称取一定质量的盐，聚合物和粗提取的菠萝汁放入离心管中，加入蒸馏水，并调节体系pH；剧烈震荡后离心，直到溶液完全分相，聚合物和目标物聚集在上相，盐聚集在下相，然后放置于冰箱里8℃放置4h，测定上相菠萝蛋白酶的活性，从而得到菠萝蛋白酶酶活回收率；测定上相蛋白质含量，结合酶的活性得到纯化因子，以此判断萃取效果；所述的盐为K₂HPO₄、 (NH₄)₃C₆H₅O₇或K₃C₆H₅O₇；体系中盐的终浓度为8-15%；/n所述聚合物为L61，体系中聚合物的浓度为5-15%；所述体系pH为4-10；/n（3）浊点法二次萃取菠萝蛋白酶并回收聚合物：将聚合物相取出，加入适量的蒸馏水进行稀释，调节溶液的pH值，放入水浴锅中保温，并离心，体系分为新的两相，水溶液和目标物聚集在上相，聚合物聚集在下相；所述溶液的pH为7；所述水浴锅中保温温度为35℃，所述离心条件为35℃下，2000转/分钟离心20分钟；/n（4）将分离后的聚合物用于下一次的双水相体系中进行循环萃取实验。/n