[发明专利]一种霍利斯格里蒙特氏菌的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种用于霍利斯格里蒙特氏菌的特异性引物，是根据副溶血性弧菌种特异性基因fur的保守区域所设计的一对外引物、一对内引物和一对环引物；本发明又公开了一种霍利斯格里蒙特氏菌的快速检测方法，包括以下步骤：霍利斯格里蒙特氏菌DNA的提取；外围引物的验证；环介导等温扩增反应体系的建立；环介导等温扩增程序的建立；扩增产物荧光信号的检测。本发明的检测方法灵敏度高，最低检测至10

主权项

1.一种霍利斯格里蒙特氏菌的快速检测方法，其特征在于：所述检测方法不是疾病的诊断方法，其包括以下步骤：/n根据副溶血性弧菌种特异性基因fur的保守区域所设计的一对外引物、一对内引物和一对环引物；/n所述的一对外引物为：/n如序列表SEQ ID NO:1所示的正向外引物GHF3：GGCAACTGTCTACCGTGTAC；/n如序列表SEQ ID NO:2所示的反向外引物GHB3：GCTGTGATTCGTCAGTCTGA；/n所述的一对内引物为：/n如序列表SEQ ID NO:3所示的正向内引物GHFIP：/nGTCGCCAGCTCAAACACAGATTTTTTTAACCAGTTTGATGATGCCGG；/n如序列表SEQ ID NO:4所示的反向内引物GHBIP：/nCACCACCATGACCACTTGGTTTGTTTTTATCTCTCTGGCGCTGCTC；/n所述的一对环引物为：/n如序列表SEQ ID NO:5所示的正向环引物GHLF：CCACCTTCAAAATGGTGACGGGT；/n如序列表SEQ ID NO:6所示的反向环引物GHLB：GTCGAGTCATCGAGTTTACGGACG；/n步骤一、霍利斯格里蒙特氏菌模板DNA的提取：/n利用100℃水浴10min热裂解或细菌基因组DNA提取试剂盒，试剂盒购于TIANGEN厦门泰京生物技术有限公司，提取霍利斯格里蒙特氏菌的总DNA作为模板；/n步骤二、外引物的验证：/n用一对外围引物GHF3/GHB3对模板进行扩增，扩增后的产物进行测序：若外围引物扩增的片段为霍利斯格里蒙特氏菌fur的保守区域核酸序列，说明该外围引物合适，可用于后续环介导等温扩增法实验；/n步骤三、环介导等温扩增反应体系的建立：/n25μL的恒温反应体系包括：反应液2×RM 12.5μL；内引物0.8μM；外引物0.1μM；环引物0.4μM；Bst聚合酶1.0μL；荧光染料I 0.5μL；DNA模板1.0μL；加超纯水至25μL；所述的反应液RM、Bst聚合酶、荧光染料I为商品化的DNA扩增试剂盒，购于广州迪澳生物科技有限公司；/n步骤四、环介导等温扩增程序：/n将待反应PCR管放置于实时荧光定量PCR仪选用FAM通道进行检测，反应程序包括1个循环63℃反应30s；40个循环：63℃反应1min，在16s处开始采集荧光信号；/n步骤五、扩增产物的检测结果判定：/n若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性，即有核酸扩增，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性，即无核酸扩增。/n