[发明专利]一种甲基转移酶活性实时测定方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种甲基转移酶活性实时测定方法及试剂盒。包括在一个反应体系内两个同时进行的反应：(1)在保证以S‑腺苷蛋氨酸为甲基供体的甲基转移酶有生物学活性的缓冲体系中，加入含有甲基转移酶(MT)的样品、甲基供体和相应的底物或者直接在含有甲基转移酶的液态样品中加入S‑腺苷蛋氨酸甲基供体和相应的底物进行反应以便产生S‑腺苷同型半胱氨酸(SAH)产物，底物为甲基的受体物质；(2)利用免疫学方法检测SAH的含量，来确定反应体系中甲基转移酶的活性。本发明把MT催化的生化反应与测定产物SAH的免疫反应同时进行，把这两个过程有机地结合起来，对于准确地测定分子性状极其不稳定的SAH尤其具有重大的意义。

主权项

1.一种甲基转移酶活性实时测定方法，其特征在于，包括在一个反应体系内两个同时进行的反应：( 1 )在保证以S‑腺苷蛋氨酸为甲基供体的甲基转移酶有生物学活性的缓冲体系中，加入含有甲基转移酶的样品、甲基供体和相应的底物或者直接在含有甲基转移酶的液态样品中加入SAM甲基供体和相应的底物，进行反应以便产生S‑腺苷同型半胱氨酸产物，底物为甲基的接受体物质；( 2 )利用免疫学方法检测SAH的含量，来确定反应体系中甲基转移酶的活性；利用包被抗原法和包被抗体法两种方式的竞争法测量S‑腺苷同型半胱氨酸的含量；1）采用包被抗原法的具体步骤如下：( 1 )不同浓度标准品的配制：取S‑腺苷同型半胱氨酸标准品，用缓冲液配制成不同浓度的标准曲线样品；( 2 )在包被有蛋白‑SAH偶联物或多聚体‑SAH偶联物的微孔板中，加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗S‑腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体，含有S‑腺苷蛋氨酸、待测甲基转移酶的样品及与待测甲基转移酶相应的甲基接受体物质的缓冲液体系；如果是液态样品，则直接加入S‑腺苷蛋氨酸、待测甲基转移酶的样品及与待测甲基转移酶相应的甲基接受体物质；标准曲线孔中加入配制好的不同浓度梯度的SAH标准品；混匀后反应，洗板；( 3 )加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的底物，显色，加入终止液终止反应，在酶标仪上选择适当波长读取每孔的吸光度读数光密度值；( 4 )在同一酶联板中用配制的一系列已知量的SAH标准品，据其光密度值与已知标准品浓度获得曲线方程，再将样本光密度值代入方程求得其对应的反应产物SAH的生成量；( 5 )根据含有甲基转移酶的样品在单位时间内催化生成产物SAH的浓度来计算甲基转移酶的活性；缓冲液是包括钾离子浓度范围在25‑200mM，BSA添加浓度在0 .1％‑0 .9％，pH范围为7 .0‑8 .5的Tris或PB缓冲系统；缓冲液配制的用于制作标准曲线的不同浓度的标准品浓度分别为0、0 .3125、0 .625、1 .25、2 .5、5、10μM；液态样品或者缓冲液中甲基供体加入后的浓度范围为10‑30μM，底物加入后的浓度范围为10‑60μM；加入每个微孔的缓冲液体系或者液态样品的体积为50μl，稀释后的示踪物标记的抗体的体积为50μl；反应时间和温度分别为37℃和20分钟；2 )包被抗体法：先将羊或兔抗鼠IgG包被的微孔板中加入抗SAH抗体孵育，或者直接包被抗SAH抗体，洗板；加入示踪物标记的SAH抗原，再加入待检抗原，待检抗原即生化反应产生的产物SAH，待检抗原与示踪物标记的SAH竞争包被在酶联板上的抗SAH特异性抗体，孵育洗板；加入底物显色，在测定过程中，用配制的一系列梯度已知量的SAH作为标准品，制作标准曲线。