[发明专利]一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法

摘要

本发明公开了一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，在体细胞核移植的电融合液中加入bta‑miR‑125b mimic，可以有效地导入到胚胎中，在避免产生转染的二次损伤的同时，还能有效地减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平，显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量。

主权项

1.一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，其特征在于：所述提高牛克隆效率的方法，由以下步骤完成：1)电融合前在50μL电融合液中加入bta‑miR‑125b mimic，使bta‑miR‑125b mimic在电融合液中的终浓度为200～500nM；将牛体细胞注入到去核卵母细胞得重构体，将重构体置于加入有bta‑miR‑125b mimic的电融合液中进行电融合；所述电融合具体包括以下步骤：将重构体在加入有bta‑miR‑125b mimic的电融合液中预平衡2～5min；然后采用微电极法进行融合，融合参数为：电压为32V、脉冲时长为20μs、2次脉冲间隔为10ms；2)在电融合后对融合得到的牛体细胞克隆胚进行激活处理，激活处理后进行胚胎培养；所述激活处理由以下步骤完成：将牛体细胞克隆胚于2～5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在38.5℃、5％CO2以及饱和湿度条件下于1～2mmol/L 6‑DMAP的mSOF溶液中培养4h；所述胚胎培养由以下步骤完成：将进行激活处理后的牛体细胞克隆胚转移到G1.5培养液中，在38.5℃、5％CO2以及饱和湿度条件下培养4h，再用G1.5培养液清洗该牛体细胞克隆胚3～5次，继续在G1.5培养液中培养56h；然后将该牛体细胞克隆胚转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5％CO2以及饱和湿度条件下培养4～5天；所述去核卵母细胞由具有极体的牛卵母细胞制备得到；所述牛体细胞为直径15～20μm的牛胎儿成纤维细胞；作为培养基的G1.5以及G2.5培养液上覆盖有石蜡油，并预先在38.5℃、5％CO2以及饱和湿度条件下平衡至少2h；所述G1.5以及G2.5培养液液滴中放置18～20枚牛体细胞克隆胚，G1.5以及G2.5培养液液滴的体积为120～150μL。