[发明专利]一种测定土壤中漆酶酶活的方法

摘要

本发明属于土壤学和环境科学领域，具体涉及一种测定土壤中漆酶酶活的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)土壤的预处理；(2)反胶束体系的制备；(3)求解ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程；(4)ABTS比色法测定漆酶酶活。本发明采用反胶束提取土壤中的漆酶，反胶束适合生物大分子的提纯，且当漆酶与反胶束接触时漆酶会进入反胶束的“水池”内，能够有效的保证提取过程中漆酶的活性，本发明用醋酸‑醋酸钠缓冲液反萃取反胶束中的漆酶，缓冲溶液能够使漆酶保持在一个相对稳定的环境中且使漆酶的酶活达到最适宜的程度，此外本发明使用的漆酶酶活检测技术简便快速且使用的反胶束溶液能够重复使用，适合批量检测。

主权项

一种测定土壤中漆酶酶活的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)土壤的预处理：将待测土壤样品取回后，放入通风橱中风干，然后将风干的土壤研磨过20目筛后备用；(2)反胶束体系的制备：将表面活性剂AOT溶解于异辛烷中，配成浓度为0.05～0.08g/mL的AOT/异辛烷混合液，然后在AOT/异辛烷混合液中加入KCl和醋酸‑醋酸钠缓冲液，然后对混合液进行超声，直到表面活性剂AOT完全溶解，并且混合溶液澄清透明，制得反胶束体系；(3)求解ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程：在6只25mL的具塞比色管中分别加入0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL的ABTS溶液，ABTS溶液的浓度为4mmol/L，然后在6只装有ABTS溶液的具塞比色管中各加入1mL漆酶溶液，漆酶溶液的酶活为1U/mL，然后在6只具塞比色管中均添加蒸馏水至25mL刻度，然后将6只具塞比色管均摇匀后放置一个小时，放置一小时后用紫外分光光度计在420nm的波长下测量6只具塞比色管中溶液的吸光度并绘制标准曲线，求出具塞比色管中混合溶液ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程：Y＝aX+b，式中：Y为ABTS自由基的浓度(μmol/L)；X为吸光度(A)；a、b为待求常数；(4)ABTS比色法测定漆酶酶活：将研磨后的土壤称取1.0～3.0g放入离心管中，并在离心管中加入10mL反胶束体系，然后将离心管放到摇床震荡1～2个小时，震荡完成后，将离心管放在离心机上以4000r/min的速度离心15～30min，离心完成后将处于上层的溶液取出放入另外干净的离心管中备用，将处于下层的土壤继续加入10mL的反胶束体系重复进行上述震荡和离心操作，重复两次，并且每个样品做三个平行试样；向取出的处于上层的溶液中加入等体积的醋酸‑醋酸钠缓冲液，并震荡15～20分钟，然后将混合溶液置于离心机中，以4000r/min的速度离心30～40分钟，离心分层后取出处于下层的漆酶溶液，实现漆酶的反萃取，在比色皿中加入1.5mL反萃取后的漆酶溶液和1.5mL的ABTS溶液，其中ABTS溶液的浓度为0.5mmol/L，然后利用紫外分光光度计在420nm的波长下，在2分钟内每隔15s测定一次比色皿中混合溶液的吸光度，求出比色皿中混合溶液吸光度与时间关系的线性方程：S＝cT+d，式中：S为吸光度(A)；T为时间(min)；c、d为待求常数；待测土壤漆酶酶活的计算公式如下：式中：e为ABTS自由基与吸光度关系的线性方程的斜率，即e等于步骤(3)中求得的常数a；f为吸光度与时间关系的线性方程的斜率，即f等于步骤(4)中求得的常数c；V1为反萃取后漆酶溶液的体积(mL)；V2为加入到比色皿中反萃取后漆酶溶液的体积(mL)；m为土壤质量(g)；V3为加入比色皿中ABTS溶液的体积(mL)。