[发明专利]一种提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法及应用

摘要

本发明一种提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法及应用，属于工业微生物领域。应用该方法得到了对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株，该藻株可用于构建生产燃料乙醇的基因工程菌。本发明的方法是通过同源重组将集胞藻PCC6803中的sll0687基因进行敲除，应用此方法得到的集胞藻PCC6803藻株IK2对乙醇的耐受能力显著提高。在1.5％(v/v)的乙醇胁迫下，该藻株的生长状态明显优于野生型藻株。本发明得到的乙醇耐受性藻株对构建生产燃料乙醇的基因工程菌具有重要的理论和实际意义，具有广泛的应用前景。

主权项

1.一种提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，通过PCR扩增得到sll0687基因上游序列sigI‑up，如序列表中SEQ ID NO：7所示；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，通过PCR扩增得到sll0687基因下游序列sigI‑down，如SEQ ID NO：8所示；以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为上、下游引物，以pET‑30b质粒为模板，通过PCR扩增得到包含卡那霉素基因及其上下游部分序列Km^r，如SEQ ID NO：9所示；(2)以限制性内切酶EcoRI和KpnI处理pUC118载体和步骤(1)得到的sigI‑up片段，将sigI‑up插入到pUC118上得到pUC118‑up质粒；以限制性内切酶BamHI和HindIII处理pUC118‑up和步骤(1)得到的sigI‑down片段，将sigI‑down插入到pUC118‑up上得到pUC118‑up‑down质粒；以限制性内切酶BamHI和KpnI处理pUC118‑up‑down和步骤(1)得到的Km^r片段，将Km^r插入到pUC118‑up‑down上得到pUC118‑up‑down‑Km^r同源双交换质粒；(3)将pUC118‑up‑down‑Km^r质粒以自然转化的方式转入集胞藻PCC6803中，得到的转化子以不同浓度的卡那霉素进行筛选，并在DNA水平上进行鉴定，最终得到sll0687基因完全敲除的单克隆藻株，即对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株，命名为IK2。