[发明专利]基于2D和3D的Caco‑2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法

摘要

基于2D和3D的Caco‑2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法，属于微生物的测定或检验方法技术领域，包括如下步骤：1）2D细胞培养；2）3D细胞培养；3）细胞传代；4）将纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中备用；5）进行纳米材料表征和细胞形态学观察，采用MTT比色法检测细胞活性，对炎症因子白细胞介素‑8进行检测，借助流式细胞仪检测不同的细胞死亡方式；使用SPSS19.0统计软件进行分析，对数据进行单因素方差分析，计算p<0.05和p<0.01的差异显著性。本发明评估了在2D和3D细胞培养模型中纳米氧化锌对细胞的生物学效应以及对纳米氧化锌毒性。这些研究对于体外探讨纳米氧化锌的肠毒性具有一定的理论意义，并为纳米氧化锌限量标准的制定提供参考。

主权项

基于2D和3D的Caco‑2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：1）2D细胞培养：将Caco‑2 细胞株加入含10% FBS和1% L‑谷氨酰胺的完全DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2 静置培养，每隔2~3天换一次细胞培养液，取对数生长期细胞进行后续试验；2）3D细胞培养：在试验前将无菌离心管分装的Matrigel胶置于冰上溶解2~3 h，再将移液器枪头和96孔培养板置于冰上冷却1 h；取10~20 μL Matrigel胶均匀的包埋细胞培养板底部，置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固；消化二维细胞，计数并稀释至2 x 10⁴/mL，分别吸取50 μL细胞悬液和Matrigel胶，按1:1混匀后转入96孔培养板，再置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固；重新凝固的胶上层滴加100 μL 含有10% FBS和1% L‑谷氨酰胺的完全DMEM培养基，在条件为37 ℃、5% CO₂的培养箱中静置培养，每隔2~3天换一次完全DMEM培养基；3）细胞传代：Caco‑2细胞贴壁生长，经过3‑4 d，细胞生长至单层80%‑95%时，弃掉上清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0.25%胰蛋白酶进行消化3‑5 min，在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量培养基，放入条件为37 ℃、5% CO²的培养箱中培养3‑4 d后，进行下一次传代培养；4）将纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度纳米氧化锌悬液；放入4 ℃冰箱中备用；每次使用前，需使用使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚，超声条件为：3 min，超3 s停2 s，功率300 w；5）进行纳米材料表征和细胞形态学观察，采用MTT比色法检测细胞活性，对炎症因子白细胞介素‑8进行检测，通过荧光显微镜观察AO/EB双染后的2D细胞死亡形态，借助流式细胞仪检测不同的细胞死亡方式；使用 SPSS19.0统计软件进行分析，对数据进行单因素方差分析，计算p<0.05和p<0.01的差异显著性。