[发明专利]一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备Fe2O3纳米粒子的方法

摘要

本发明公开了一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备Fe2O3纳米粒子的方法，包括如下步骤：(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白：①、确定重组胶原蛋白的序列；②、合成编码重组胶原蛋白的核酸；③、重组胶原蛋白的制备与纯化；(2)α‑Fe2O3纳米材料的制备：①、重组胶原蛋白与六水合三氯化铁均匀混合溶液的配制；②、利用水热反应釜制备纳米级α‑Fe2O3；③、纯化并干燥保存制备的纳米材料。本发明采用重组胶原蛋白作为生物模板，六水合三氯化铁作为原料，通过水热方法，制备了大小和形貌可控的α‑Fe2O3纳米材料。本发明在整个合成过程中无需添加任何其他化学试剂或进行后处理，简单方便，易于操作，具有很大的应用前景，可为规模化生产α‑Fe2O3纳米材料提供基础。

主权项

1.一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备Fe2O3纳米粒子的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白①、确定重组胶原蛋白的序列；重组胶原蛋白的序列为：GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；具有整合素的结合位点GERGFPGERGVE，可以与细胞很好的粘附；具有肝素的结合位点GRPGKRGKQGQK，可以与肝素结合；②、合成编码重组胶原蛋白的核酸；合成编码步骤①重组胶原蛋白的核酸，构建导入上述核酸的质粒，并将质粒转化大肠杆菌BL21‑DE3菌株；③、重组胶原蛋白的制备与纯化；将冰冻在‑80℃的大肠杆菌感受态细胞置于冰浴中融化，将感受态细胞与3‑5μL质粒混合，混合体在冰浴中30min后再放入42℃水浴中90s，然后再放入冰浴中2min；在上述混合体中加入1mL不含抗生素的LB培养基，再放置于37℃恒温摇床中1hrs，然后在4℃，4000rpm条件下离心20min，弃去上层清液；使细菌在剩余培养液中重新悬浮后，将培养液均匀涂布到37℃的AMP培养平板上，置于37℃恒温摇床中过夜培养；次日挑取长势较好的菌落放入100mL含抗生素的LB液体培养基中，恒温摇床过夜进行增菌培养；将100mL过夜培养的细菌倒入1LLB培养基中，在37℃恒温摇床中继续扩增培养；待OD值达到0.8‑1范围，将摇床温度调为25℃，加入1mMIPTG诱导表达，恒温过夜培养；将上述蛋白已表达的细菌在低温离心机中离心，使菌体与培养基分离，离心条件：12000rpm，4℃，离心1.0‑3.0min；将离心后的菌体用A缓冲液溶解，A缓冲液为20mM咪唑，20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH为7.4；将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于A缓冲液中；超声时需将细菌悬浊液放于冰浴中，以防温度过高导致蛋白变性；将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：14000rpm,4℃，30‑50min；收集上清液，此即为粗蛋白溶液；将粗蛋白过滤后，通过液相色谱进行进一步纯化；后经冻干，得到白色絮状固体；此固体放于‑20℃冰箱保存，使用时通过称重法标定浓度；(2)α‑Fe2O3纳米材料的制备①、重组胶原蛋白与六水合三氯化铁均匀混合溶液的配制；在1mL水中加入1‑50mg六水合三氯化铁和0‑10mg胶原蛋白固体，混合均匀，缓慢搅拌5‑90min后，得到淡黄色透明且均匀的液体；②、利用水热反应釜制备纳米级α‑Fe2O3；将所得混合液倒入5mL水热反应釜中，放入马弗炉内以3‑18℃/min的速度升温至120‑200℃，并在该温度下反应1‑15hrs；③、纯化并干燥保存制备的纳米材料；待水热反应釜冷却到室温后，将产物通过离心分离，离心条件为1200rpm，弃去上清液，留下固体；并用去离子水分散固体，再离心纯化3‑5次，在50‑80℃恒温干燥箱中干燥。