[发明专利]诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法有效
申请号: | 201610300819.9 | 申请日: | 2016-05-09 |
公开(公告)号: | CN105969733B | 公开(公告)日: | 2019-04-16 |
发明(设计)人: | 刘妍;曹诗颖;胡瑶;陈成;徐敏 | 申请(专利权)人: | 南京医科大学 |
主分类号: | C12N5/0793 | 分类号: | C12N5/0793 |
代理公司: | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人: | 李昊 |
地址: | 210029 *** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | 本发明公开一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法,包括以下步骤:1)将hPSCs贴壁培养,待形成边缘光滑,大小均一,内部致密的克隆后消化制成拟胚体,在神经诱导培养液中悬浮培养;2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂;3)在分化第7天进行贴壁,第10天得到神经管样细胞结构;4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下,第17天将形成球状神经前体细胞;5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁,得到大脑皮质神经元;6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁,加入神经营养因子培养,在分化90天后,获得谷氨酰胺能神经元。 | ||
搜索关键词: | 诱导 分化 hpscs 谷氨酰胺 神经元 方法 | ||
【主权项】:
1.一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法,其特征在于,包括以下步骤:1)将hPSCs贴壁培养,待形成边缘光滑,大小均一,内部致密的克隆后消化制成拟胚体,在神经诱导培养液中悬浮培养;2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂;3)在分化第7天进行贴壁,第10天得到神经管样细胞结构;4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下,第17天将形成球状神经前体细胞;5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁,得到大脑皮质神经元;6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁,加入神经营养因子培养,在分化90天后,获得谷氨酰胺能神经元;所述步骤1)将hPSCs贴壁培养,待形成边缘光滑,大小均一,内部致密的克隆后消化制成拟胚体,在神经诱导培养液中悬浮培养具体为:将hPSCs贴壁培养于在室温下用基质胶Vitronectin提前2小时包被过的培养皿中;hPSCs所用培养液为Essential 8,由体积比为50∶1的Essential8TM Basal Medium与Essential 8TM Supplement 50X配制而成;hPSCs在培养皿中增殖为边缘光滑,大小均一,内部致密的克隆后,加入1ml 1Uml‑1Dispase于37℃,5%CO2的孵箱中孵育2分钟,移至显微镜下观察,克隆边缘发亮,并微微卷起时,将Dispase吸除;用DMEM/F12轻洗细胞,10‑20s后吸走,再加入DMEM/F12轻轻将克隆吹下,一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至15ml离心管中;将装有细胞和DMEM/F12的离心管离心,800rpm,1min;吸除上清,将管底的细胞转移至细胞培养瓶,换上神经诱导培养液Neural induction medium,将细胞制成拟胚体,在神经诱导培养液中悬浮培养,其中,神经诱导培养液NIM为DMEM/F12培养基,NEAA,N2以体积比98∶1∶1配制而成;所述步骤2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂,具体为:分化第1天在神经诱导培养液中加入腹侧化因子SHH的抑制剂Cyclopamine,浓度为2‑20μM,并且在分化第1‑3天时加入体积为培养 液体积5%的血清替代物KOSR,分化第1天至分化第4天,每天半换液,4天之后,隔天半换液,更换的培养液均为加入Cyclopamine的神经诱导培养液,持续至分化第25天;所述步骤3)在分化第7天进行贴壁,第10天得到神经管样细胞结构具体为:分化第7天时把拟胚体从培养瓶吸出置于离心管中,用头轻吹打2‑3次;待细胞自然沉降到管底后,吸走上清,留少量培养基,用枪将拟胚体吸出,置于细胞培养皿中,每个培养皿中大约含50个拟胚体,细胞培养液为1.5ml,由90%NIM+10%FBS配制而成;10小时后更换为加入Cyclopamine的神经诱导培养液;所述步骤4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下,第17天将形成球状神经前体细胞,具体为:分化第16天,用1ml的枪将形成神经管样细胞结构吹下,转移至15ml离心管中自然沉降,弃上清,将管底细胞转移至细胞培养瓶中,培养液为加入Cyclopamine的神经诱导培养液,并在其中加入B27和Rock inhibitor;体积比为98∶2∶0.01;分化第17天,细胞将形成球状神经前体细胞;所述步骤5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁,得到大脑皮质神经元具体为:分化第20天将神经前体细胞贴壁分化;在贴壁提前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly‑l‑ornithine hydrobromide提前处理过的玻片,80ul/片;用1ml的枪吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中,使其自然沉淀,弃上清,加入1ml的TrypLE酶,置于37℃的孵箱中孵育6min;吸出TrypLE,加入1mlDMEM/F12重悬,待神经前体细胞自然沉降到管底后吸去上清;再加入500ulDMEM/F12,用200ul的枪头逐级吹打细胞;吸取10ul进行细胞计数,以4x104个/ml的密度种于玻片上,每个玻片100ul,2hours后补液至500ul,培养液为NIM与B27,体积比为NIM∶B27=98∶2;每隔一周半换液;剩余的神经前体细胞继续在培养瓶中培养,所用培养液仍然为含有Cyclopamine的神经诱导培养液;在分化第26天时,将Cyclopamine从神经诱导培养液中撤出,使用NIM神经诱导培养液;所述步骤6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁,加入神经营养因子培养,在分化90天后,获得谷氨酰胺能神经元具体为:在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁分化,在贴壁前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly‑1‑omithine hydrobromide提前处理过的玻片,80ul/片;用1ml的枪吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中,使其自然沉淀,弃上清,用10ul的枪头将神经前体细胞吸出,按10个/玻片的密度种于玻片上,每个玻片100ul,2hours后补液至500ul,培养液为NIM,包含2%B27和神经营养因子10ng ml‑1BDNF、1μM CAMP,每隔一周半换液,培养至第90天。
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- 何晓婷;张金保 - 妙顺(上海)生物科技有限公司
- 2015-05-20 - 2018-08-21 - C12N5/0793
- 一种成年大鼠海马神经元体外分离培养方法,包括以下步骤:包被培养板;分离大鼠脑;分离海马;制备细胞悬液;神经元进一步纯化;细胞接种;体外原代培养。本发明的目的在于提供一种高纯度、高活性海马神经元的获取(分离、纯化)以及适用于成年大鼠海马神经元体外长期培养的流动式培养体系的构建。
- 脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法-201810054859.9
- 龚薇;斯科;黄理蒙 - 浙江大学
- 2018-01-19 - 2018-07-20 - C12N5/0793
- 本发明公开了一种脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法。提取胎鼠大脑,分离皮层组织,消化处理;去除组织杂质,然后于第一培养液中制备细胞悬液;将细胞悬液接种于培养皿,置于细胞培养箱内培养,获得原代神经元培养液;原代神经元培养液中加入腺相关病毒进行神经元转染;转染后不断换液。本发明培养的原代神经元状态良好,转染方法稳定、高效、快速、可进行大基因片段转染。
- 神经前体细胞群体及其用途-201680071312.9
- 科里·尼古拉斯;路易斯·富恩蒂尔巴;童卓卡;玛丽娜·伯施泰恩;索尼娅·克里克斯;斯图尔特·钱伯斯 - 神经元治疗公司
- 2016-10-10 - 2018-07-17 - C12N5/0793
- 本发明提供了富集特定神经前体标志物的细胞群体和使用此类细胞群体用于治疗与抑制性神经元功能失调和/或兴奋性/抑制性神经元活性不平衡相关的紊乱的方法。具体地,本发明提供了用作基于细胞的治疗剂的细胞群体,和用于纯化并在移植中使用这些神经前体细胞以改善与异常神经功能相关的神经紊乱的方法。
- 一种用于神经突触形成分析中的细胞共培养方法-201510450630.3
- 阳小飞;蒋伟;陈健;王明明;龚吉红;梅颖 - 中南民族大学
- 2015-07-28 - 2018-07-13 - C12N5/0793
- 本发明提供了一种用于神经突触形成分析中的细胞共培养方法,包括以下步骤:将传代培养的非神经元细胞即HEK293 T细胞加入到体外环境中24孔原代培养的神经元细胞中,混合后培养24小时以上;采用PEI转染法,转染HEK293 T细胞,每个孔中所转染的外源基因均不相同,被转染后的HEK293 T细胞过表达外源基因,在此条件下进行共培养48小时以上;免疫染色突触前的标记蛋白synapsin,从而判断每一孔中是否形成突触结构。本发明所提供的共培养方法解决了现有技术中的不足,该方法操作简单、方便,成本相对较低,耗时短,可以很好的筛选基因及验证基因功能,可以广泛用于实验室。
- 一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具-201720070906.X
- 武珅;王宁利;张敬学;毛迎燕;李昱辉;徐峰 - 李昱辉;徐峰
- 2017-01-20 - 2018-05-01 - C12N5/0793
- 本实用新型提供了一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具,所述模具包括玻璃片、梯形水凝胶层和含神经元细胞的水凝胶层,所述梯形水凝胶层通过梯形槽定形为梯形,所述含神经元细胞的水凝胶层位于梯形水凝胶层的头端(H),梯形水凝胶层和含神经元细胞的水凝胶层凝固于玻璃片上。本实用新型通过两次光聚合,制备得到“头高尾低”的梯形轴突生长水凝胶,并将神经元细胞固定于轴突生长凝胶的头端(H),在垂直轴突生长凝胶方向加载固定大小的外力,利用凝胶受力后形变程度不同所形成梯度应力,模拟神经元长轴突所感受到的压力梯度。
- 一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具及其制备方法和应用-201710042160.6
- 武珅;王宁利;张敬学;毛迎燕;李昱辉;徐峰 - 李昱辉;徐峰
- 2017-01-20 - 2018-04-24 - C12N5/0793
- 本发明提供了一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具及其制备方法和应用,所述模具包括玻璃片、梯形水凝胶层和含神经元细胞的水凝胶层,所述梯形水凝胶层通过梯形槽定形为梯形,所述含神经元细胞的水凝胶层位于梯形水凝胶层的头端(H),梯形水凝胶层和含神经元细胞的水凝胶层凝固于玻璃片上。本发明通过两次光聚合,制备得到“头高尾低”的梯形轴突生长水凝胶,并将神经元细胞固定于轴突生长凝胶的头端(H),在垂直轴突生长凝胶方向加载固定大小的外力,利用凝胶受力后形变程度不同所形成梯度应力,模拟神经元长轴突所感受到的压力梯度。
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