[发明专利]CRISPR技术编辑并用IGF优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用有效
| 申请号： | 201610297972.0 | 申请日： | 2016-05-06 |
| 公开（公告）号： | CN105985985B | 公开（公告）日： | 2019-12-31 |
| 发明（设计）人： | 李杨欣;沈振亚;邵联波 | 申请（专利权）人： | 苏州大学 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N9/22;C12N15/867;A61K35/28;A61P9/10 |
| 代理公司： | 32224 南京纵横知识产权代理有限公司 | 代理人： | 董建林;薛海霞 |
| 地址： | 215000 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明属于异体间充质干细胞应用领域，具体涉及CRISPR技术编辑并用IGF优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用，包括如下步骤：利用密度梯度离心法分离获得异体的单个核细胞，然后通过贴壁培养获得间充质干细胞；设计间充质干细胞表面抗原B2M‑gRNA，炎症因子TNF‑α‑gRNA；构建重组的慢病毒颗粒并转染间充质干细胞；用IGF‑1优化间充质干细胞；利用改造和优化后的间充质干细胞来制备治疗心肌梗死的药物。本发明利用CRISPR/Cas9技术清除异体间充质干细胞表面导致免疫排斥的抗原以及引起炎症反应的炎症因子，并用IGF‑1提高间充质干细胞的抗凋亡能力、促进其归巢，为临床治疗心血管疾病的药物的制备提供一套新的技术方案，所制备的异体间充质干细胞移植后不会引起免疫排斥。 | ||
| 搜索关键词： | crispr 技术 编辑 并用 igf 优化 异体 间充质 干细胞 制备 方法 治疗 心梗中 应用 | ||
【主权项】：
1.CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)利用密度梯度离心法分离获得异体的单个核细胞，通过贴壁培养获得异体间充质干细胞；/n(2)分别设计转录间充质干细胞表面抗原B2M、炎症因子TNF-α引导RNA(gRNA)对应的DNA序列：/nB2M-gRNA对应DNA oligo序列为5’-AGTCACATGGTTCACACGGC AGG-3’； TNF-α-gRNA对应的DNA oligo序列为5’-TATCTCGACTT TGCCGAGTCTGG-3’/n(3)将B2M-gRNA对应的DNA oligo序列磷酸化聚合在一起形成双链后导入到LentiCRISPR v2载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得B2M重组慢病毒颗粒；将TNF-α-gRNA对应的DNA oligo序列导入到LentiCRISPR v2载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得TNF-α重组慢病毒颗粒，将得到的B2M重组慢病毒颗粒和TNF-α重组慢病毒颗粒同时侵染异体间充质干细胞；筛选阳性细胞并扩增培养；/n(4)用含有浓度为10~30ng/ml IGF-1分子的无血清人间充质干细胞（hMSC）培养基低氧条件下培养异体间充质干细胞48小时，低氧条件指O
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